Geri Dön

Bacillus subtilis GntR ailesine ait LutR transkripsiyon faktörünün doğrudan kontrolü altındaki genlerin CHIP ve EMSA yöntemleriyle belirlenmesi

Determination of genes under the direct control of GntR-type transcriptional factor LutR in Bacillus subtilis PY79 by CHIP and EMSA methods

PDF İndir

  1. Tez No: 397770
  2. Yazar: MURAT KEMAL AVCI
  3. Danışmanlar: PROF. DR. AYTEN KARATAŞ
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Mikrobiyoloji, Biotechnology, Genetics, Microbiology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2015
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 230

Özet

LutR transkripsiyon faktörü GntR familyasının bir üyesi olup B. subtilis'te lutR geni tarafından kodlanan global düzenleyici bir proteindir. lutR geni ilk keşfedildiğinde“yvfI”olarak adlandırılmış fakat laktat kullanımında görevli olduğu belirlendiğinde“lutR”(Lactate utilisation gene) adıyla tekrar adlandırılmıştır. B. subtilis LutR proteini, E. coli FadR regulatör proteini ile homologdur. LutR protein dizisi, GntR süperfamilyasının FadR alt familyasındaki farklı türlere ait ortologlarıyla da önemli homolojiye sahiptir. Ayrıca FadR benzeri proteinler birçok metabolik yolun regülasyonunda rol alırlar. GntR familyası DNA'ya bağlanmak için Heliks-Turn-Heliks (HTH) motifi kullanan regulator proteinlerden oluşan bir HTH-tip protein süperfamilyasıdır. Farklı çalışmalardaki CDD analizlerinde, GntR familyasında oldukça yaygın olan“FadR C-terminal ligand bağlanma bölgesi”nin, LutR C-terminalinde de yer aldığı tespit edilmiştir (PFAM 07729). Buna ek olarak LutR N-terminalinde bulunan 44 amino asitlik bölge ile GntR wHTH domain arasında önemli bir benzerlik olduğu belirlenmiştir (PF00392). GntR familyasına ait üyeler N-terminalde HTH motifi içeren bir DNA bağlanma domaini (DBD) ve C-terminalinde bir efektör bağlanma veya oligomerizasyon (EBD) domaininden oluşurlar. Bu proteinler DNA'ya bağlanmak için kullandıkları heliks-turn-heliks (HTH) motifi ile karakterize edilirler. DNA-bağlanma domaininin dışındaki bölgeler çok farklılık gösterirken, küçük bir β-tabaka ile beraber 3-heliksli bir çekirdekten oluşan DNA-bağlanma bölgesi bütün GntR familyasında oldukça iyi korunmuştur. Bacillus genusu üyeleri arasında antibiyotik üreten ana suş B. subtilis'tir. Yaklaşık 30 kadar antibiyotik üreten B. subtilis'e ait antibiyotikler oldukça farklı antimikrobiyal aktivite göstermektedir. Bunlardan bazıları gram pozitif, bazıları gram negatif mikroorganizmalara etki ederken, bazıları daha geniş spektrumda etkilidir. B. subtilis genomunda yaklaşık 350 kb'lık bir bölge antibiyotikleri kodlayan genleri içermekte olup, toplam genomun %4-5'ini oluşturmaktadır. Yapısal olarak oldukça değişken olan B. subtilis antibiyotiklerinin en önemli özelliklerinden biri fonksiyonel açıdan sadece antimikrobiyal ajan olarak görev yapmayıp, ayrıca hücre morfolojisi ve fizyolojisinin düzenlenmesinde de etkili olmalarıdır. Basilisin [L-alanine-(2.3-epoxycyclohexanone-4)-L-alanine] non-ribozomal yolla sentezlenen dipeptit yapıda bir antibiyotiktir. B. subtilis'te basilisin biyosentezinden polisistronik bir operon olan bacABCDEF (eski adı ywfBCDEFG) ve monosistronik bir gen olan ywfH sorumludur. Basilisin, N-terminalde L-alanin ve C-terminalde non-proteinojenik L-antikapsin rezidülerinden oluşur. Antibiyotik etkisinin görülmesi için L-antikapsin rezidüsünün serbest kalması gerekir. Bu, ancak basilisin bir peptidaz tarafından proteoliz edildiğinde gerçekleşir. Basilisin bir peptidaza maruz kalmadan önce bir peptit permeaz tarafından sitosöle transfer edilir ve L-antikapsin burada bir peptidaz tarafından serbest bırakılır. Dipeptit antibiyotik basilisin biyosentezi; B. subtilis'de global düzenleyiciler olarak görev yapan ComA, SpoOA, AbrB, ScoC, ve CodY proteinlerinin kontrolü altındadır. Bu kompleks regülasyon ağına, GntR tip transkrisiyon faktörü LutR'ında katıldığı belirlenmiştir. Akabinde L-laktat kullanımından sorumlu lutABC (eski adı yvfV-yvfW-yvbY) operonunun da LutR'ın kontrolü altında olduğu bulunmuştur. Son olarak, grubumuz tarafından yürütülen çalışmalar neticesinde; LutR ın, L-laktak kullanımı ve basilisin biyosentezinin yanı sıra, karbonhidrat kullanımı ve transportu, nitrojen metabolizması, fosfat alımı, yağ asidi ve fosfolipit biyosentezi, protein sentezi ve translokasyonu, hücre duvarı metabolizması, enerji üretimi, mobil genetik element transferi, fajla ilgili genlerin indüksiyonu, sporilasyon, sporilasyonun gecikmesi ve kanibalizm ve biyofilm oluşumu gibi pek çok farklı fizyolojik ve metobolik süreçte görev yapan birbirinden bağımsız birden fazla geni/operonu kontrol eden pleiotropik bir global regülatör olduğu bulunmuştur. N-terminalinde helix-turn-helix motifi içeren diğer bir protein SinR'dır. SinR proteini B. subtilis'te geç üreme sürecinde kompetans ve motilite gelişimini aktive ederken sporilasyon ve ekzoproteaz üretimini inhibe ederek çift yönlü düzenleyici rol sergilemektedir. SinR, Spo0A gibi pleitropik bir düzenleyici anahtar gibi hareket eder ve adaptif cevapların gelişmesini sağlayarak gereksiz olan potansiyel diğer cevapları engeller. lutABC operonu, hem LutR hem de SinR proteininin kontrolü altındadır. LutR ve SinR proteinleri birlikte hareket ederek lutABC operonunu baskılamaktadırlar. Biyofilm olarak bilinen uzun hücre zincirlerini bir arada tutan ekstrasellüler matriksten sorumlu epsA-O ve yqxM-sipW-tasA operonlarına ait 18 genin de SinR tarafından baskılandığı bilinmektedir. Bu tez çalışmasının temel amacı LutR transkripsiyon faktörünün, B. subtilis genomunda, doğrudan bağlanarak düzenlediği genlerin belirlenmesidir. Bu amaçla E. coli pQE60::lutR suşunda heterolok olarak üretilen ve saflaştırılan LutR proteini ile B. subtilis PY79 suşuna ait kromozomal DNA kullanılarak, amacımıza göre modifiye ettiğimiz in vitro kromatin immünopresipitasyon (ChIP) yöntemi uygulanmıştır. Sonrasında, LutR proteininin, uygulanan modifiye-ChIP yöntemi ile yakalanan aday genlere doğrudan bağlandığını doğrulamak için EMSA yöntemi kullanılmıştır. In vitro olarak doğrulanan söz konusu etkileşimlerin, gen ifadesi üzerinde pozitif veya negatif yöndeki etkisini belirlemek amacıyla da, ayrıca RT-qPCR yönteminden yararlanılmıştır. ChIP yöntemi kullanılarak yapılan bu çalışmada LutR proteininin doğrudan kontrol ettiği genlerden yuxO (comB, comAB) geni belirlenmiştir. Bunlara ilaveten, Dr. Öykü İrigül-Sönmez'in doktora tez (2012) çalışması kapsamında lutR geninin aşırı ifade edildiği, PY79 (amyE::Pspac::lutR lutR::Tn10::spc) suşunda gerçekleştirilen mikroarray analizleri sonucunda, lrpB, yodT, rpsP, yutK, nasA, yvsG, ytsD ve yvnB genlerinin, LutR'ın direk kontrolü altında olabileceği belirlenmiştir. Bu bulguların kesinlik kazanması için bu tez kapsamında uygulanan EMSA analiz sonuçları, söz konusu lrpB, yodT, rpsP, yutK, nasA, yvsG, ytsD ve yvnB genlerinin, direk LutR proteini tarafından kontrol edildiğini göstermiştir. Bunlara ek olarak, grubumuz tarafından sürdürülen daha önceki farklı araştırmaların sonuçları, SinR global regülatör proteinininin, test ettiğimiz LutR'ın direk kontrolü altında bulunan tüm genlere bağlanma kapasitesinin bulunduğunu göstermiştir. Bu bilgi doğrultusunda tez kapsamında yapılan EMSA analizlerinde LutR ve SinR proteinleri birlikte kullanılarak, LutR ve SinR'ın birlikte düzenledikleri olası yeni genlerin aydınlatılması amaçlanmıştır. Bu kapsamda yapılan EMSA analizleri sonucunda; LutR ve SinR proteinlerinin yuxO, lrpB, yodT, rpsP, yutK, nasA, yvsG, ytsD ve yvnB gen transkripsiyon seviyelerini birlikte düzenledikleri belirlenmiştir. Son olarak, deneysel analizlere paralel bir şekilde, karşılaştırmalı in silico analizler ve karakterizasyon çalışmalarıyla LutR proteinine ait biyoinformatik verilerin elde edilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla iki analiz yolu takip edilmiştir. İlk analiz yolunda, çeşitli biyoinformatik araçlar yardımıyla farklı türlere ait LutR proteinlerinin fizikokimyasal, yapısal ve filogenetik özellikleri incelenmiş ve LutR'ın türler arasındaki benzerlik ve farklılıkları ortaya çıkarılmıştır. İkinci analiz yolunda ise sadece B. subtilis 168 suşuna ait LutR proteininin, kristallografik analizleri tamamlanmış ve yapısı iyi bilinen GntR-HTH-tip transkripsiyon faktörleri FadR ve YvoA ile PyMOL programı yardımıyla yapısal olarak karşılaştırılması yapılmıştır. Ayrıca bu tez çalışmasında kullanılan ChIP yöntemi için oluşturulan prosedür, prokaryotik sistemlere yönelik olması ve antikor kullanılmaksızın uygulanması açısından metodolojik bir yenilik sunmaktadır.

Özet (Çeviri)

LutR transcription factor, one of the members of GntR family, is a global regulatory protein encoded by lutR gene in B. subtilis. When lutR gene was first discovered, it was named as“yvfI”. But it was re-named as“lutR”(Lactate utilisation gene), when lutR was found to be involved in lactate utilization. B. subtilis LutR protein is a homolog of E. coli FadR regulatory protein. The sequence of LutR protein has also a significant homology with orthologs of the different species in FadR subfamily of GntR superfamily. Additionally, FadR-like proteins are involved in the regulation of many metabolic pathways. GntR family is the HTH-type protein superfamily consisting of regulatory proteins which contain a Helix-Turn-Helix (HTH) motif to bind to DNA. CDD analysis in different studies revealed that“FadR C-terminal ligand-binding region”, which is quite common in GntR family, also has been found in LutR C-terminal (PFAM 07729). Furthermore, it was determined that there is a significant similarity between the 44 amino acids at the LutR N-terminus and the GntR wHTH domain (PF00392). A member of GntR family contains a DNA-binding domain (DBD) with HTH motif at N-terminus and an effector-binding or oligomerization (EBD) domain at C-terminus. The DNA-binding region including a small β-strand and 3-helix core is highly conserved in all GntR family, while the other regions out of the DNA-binding site may be highly variable. The main antibiotic producer member of Bacillus genus is B. subtilis. Approximately 30 different antibiotics are known to be produced by B. subtilis and most of them act against a wide range of bacteria. Approximately 350-kb region in B. subtilis genome includes antibiotic encoding genes and this region constitutes 4-5% of total genome. The most important feature of B. subtilis antibiotics they cannot only act as antimicrobial agent, but also effect the regulation of cell morphology and physiology. Bacilysin [L-alanine-(2.3-epoxycyclohexanone-4)-L-alanine] is a dipeptide antibiotic produced by non-ribosomal pathway. A monocistronic gene ywfH and a polycistronic bacABCDEF (formerly ywfHBCDEFG) are responsible for bacilysin biosynthesis in B. subtilis. Bacilysin is composed of two amino acids; L-alanine at N-terminus and non-proteinogenic L-anticapsin at C-terminus. The antimicrobial activity of bacilysin depends on its proteolytic cleavage into L-alanine and L-anticapsin by a peptidase after its transport into the cells. Since L-anticapsin causes to lysis of bacterial or fungal cells by inhibiting activity of glucosamine synthase. Together with global regulators ComA, Spo0A, AbrB and CodY, LutR was found to participate to the regulation of bacilysin biosynthesis. On the other hand, a very recent study performed by our group indicated that LutR is a pleiotropic regulator that is involved in the regulation of a wide variety of cellular processes associated with the onset of stationary phase, such as degradative enzyme production, antibiotic production and resistance, carbohydrate utilization and transport, transfer of mobile genetic elements, induction of phage related genes, sporulation, sporulation delay and cannibalism, and biofilm formation. The other protein including helix-turn-helix at N-terminal is SinR. SinR protein exhibits dual regulatory role because it activates the competence and motility during late-growth periods in B. subtilis, but inhibits sporulation and exoprotease production. SinR acts as a pleiotropic regulatory key molecule such as Spo0A and prevent the other unnecessary potential responses by providing the development of adaptive responses. lutABC operon was also found to be under the control of both LutR and SinR. These proteins repress lutABC operon acting together. It is known that 18 gene is also repressed by SinR. These genes are belonging to epsA-O and yqxM-sipW-tasA operons responsible for the extracellular matrix holding together the long cell chains known as biofilm. Environmental conditions in microbial growth media change quickly and continuously. These sudden alterations threat to the survival of the cells. Therefore, it is an extremely critical necessity for each cell to be adapted to the environmental contiditions in the fastest and most convenient way. B. subtilis cells regulate its metabolism according to the environmental conditions by genome-wide controlling the gen expression via quorum sensing mechanism. Quorum sensing is a mechanism, which microorganisms communicate each-other using some chemical signal molecules in the environment in order to create an adaptational behavior depending on the increasing cell population. Bacteria synthesize these molecules in cytoplasma, then secrete them out of cell and sense these small, signalling molecules that accumulate in the growth medium as cells grow to high density. Quorum sensing signal molecules can be N-acyl-homoserine lactones (AHLs) for Gram-negative bacteria, or small peptides for Gram-positive bacteria or furan derivatives for some gram positive and negative bacteria. Bacillus subtilis is a model organism for scientific research because of it is one of the best-studied microorganisms, its genome sequencing is completed, its non-pathogenicity, easy handling, easy transformability, high growth rate, adaptive metabolism. B. subtilis cells are a rod-shaped, aerobic or facultative aerobic, endospore-forming bacteria. Bacillus subtilis is able to respond to the changes in its environment in order to survive. B. subtilis regulates its genes by quorum sensing mechanism to manage the optimal growth conditions. All phenotypes such as motility, chemotaxis, competence, degradative enzyme and antibiotic production, competition with the competitors, secretion of enzymes such as proteases and sporulation are controlled strigently by using quroum sensing. In this thesis, the main aim is to determine the genes under the direct control of LutR in B. subtilis. For this purpose, we applied in vitro chromatin immunoprecipitation (ChIP) method modified according to our purpose. The LutR protein produced and purified as a recombinant protein in E. coli pQE60::lutR strain. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) was also used to verify that LutR protein binds directly to the candidate genes determined by our modified-ChIP method. Additionally, RT-qPCR methods were used to determine the effects of LutR on the expression of those genes. Furthermore, in the doctoral thesis of Öykü İrigül-Sönmez (2012), it was determined the lrpB, yodT, rpsP, yutK, nasA, yvsG, ytsD and yvnB genes could be under the direct control of LutR. These results obtained from microarray analysis applied with B. subtilis PY79 (amyE::Pspac::lutR lutR::Tn10::spc) strain which overexpresses lutR gene. In the present study, we used EMSA methods to gain certainty about which of those genes expressions (lrpB, yodT, rpsP, yutK, nasA, yvsG, ytsD and yvnB) are affected directly by LutR protein. Previous study of our group indicated that SinR is capable of interacting with the regulatory regions of all of the LutR-target genes tested. According to this data, it was aimed to highlight the possible new genes regulated by both LutR and SinR, EMSA analysis were performed in the presence of both regulators. The results of these EMSA analysis indicated that LutR and SinR proteins regulate the gene expressions of yuxO, lrpB, yodT, rpsP, yutK, nasA, yvsG, ytsD and yvnB genes together. Finally, besides to experimental analysis, it was aimed to obtain bioinformatic data about LutR protein by comparative in silico analysis and charachterization studies. For this purpose, we performed two different approaches: In first analysis, the physichochemical, structural, and phylogenetic features of LutR proteins belonging to different species were studied by several bioinformatic tools and determined the similarities and differentiations among various species. In the second analysis, structural comparative analysis of only one LutR protein belonging to B. subtilis 168 with well-known GntR HTH type transcription factors FadR and YvoA was accomplished by PyMOL. As the last, the procedure developed for ChIP method in this thesis provides a methodological innovation because it is not only useful for procaryotic systems but also it can be applied without antibody usage.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    352331

    Detection of YvfI-SinR co-regulated genes and the effect of DegU transcriptional factor on the expression of YvfI gene in Bacillus subtilis

    YvfI-SinR proteinleri tarafından birlikte düzenledikleri genlerin belirlenmesi ve Deg-U transkripsiyon faktörünün Bacillus subtilis' deki YvfI gen ekspresyonuna etkisi

    BÜŞRA ÖZTÜRK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ

  2. Tez No

    315332

    Genome-wide analysis of yvfI gene in Bacillus subtilis

    Bacillus subtilis?de yvfI geninin genom ölçeğinde analizi

    ÖYKÜ İRİGÜL SÖNMEZ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2012

    Genetikİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ

  3. Tez No

    251759

    The effects of global control elements on the expression of a novel GntR type regulator yvfI in B. subtilis

    Global kontrol elemenlarının B. subtilis?te yeni bir GntR tipi düzenleyici gen olan yvfI?nın gen ifadesi üzerindeki etkileri

    EMİNE CANAN ÜNLÜ ÖZKURT

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2009

    Genetikİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ

  4. Tez No

    310701

    Effect of transcriptional factors ComK and Hpr on the expression of bacABCDE, ywfH and yvfI genes in Bacillus subtilis

    Bacillus subtilis?de ComK ve Hpr yazılma faktörlerinin bacABCDE, yvfI ve ywfH genleri üzerine etkisi

    TÜBA GÜN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2011

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ

  5. Tez No

    439552

    Regulatory effect of transcriptional factor SinR and LutR on the expression of bacABCDEywfG operon in Bacillus subtilis

    Bacillus subtilis'de SinR ve LutR transkripsiyon faktörlerinin bacABCDEywfG operonu üzerine düzenleyici etkisi

    HASAN DEMİRCİ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYTEN KARATAŞ

Geri Dön