Geri Dön

Molecular and physiological characterization of a salt-resistant Saccharomyces cerevisiae mutant obtained by evolutionary engineering

Evrimsel mühendislik yöntemiyle elde edilmiş tuza dirençli bir Saccharomyces cerevisiae mutantının moleküler ve fizyolojik karakterizasyonu

PDF İndir

  1. Tez No: 397999
  2. Yazar: ŞEYMA HANDE TEKARSLAN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR, PROF. DR. CAROLA HUNTE
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Genetik, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2015
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 198

Özet

Maya; moleküler biyoloji, hücre morfojenezi, kromozom stabilitesi ve hatta yaşlanma için mükemmel bir model oluşturmaktadır. Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7D endüstri ve akademideki metabolik mühendislik ve sistem biyolojisi çalışmalarında geniş kullanım alanına sahiptir. 1990'larda Alman maya araştırmacılarından oluşan bir konsorsiyum S.cerevisiae'ın, farklı laboratuvar suşlarını çaprazlayarak CEN.PK suşlarının izogenik ailesini geliştirmişlerdir. Alkali katyon homeostazinin sağlanması maya da dahil olmak üzere çoğu hücre tipinde anahtar prosestir. Sodyum klorür insan biyolojisi için çok önemlidir. Na+ ve K+ insanda beslenme için gereklidir ve Li+ ise kemirgen ve keçilerde gerekli bir besin bileşenidir. Tomurcuklu bir maya olan S. cerevisiae harici K+ konsantrasyonu (10 mM–2.5 M) ve Na+ (1.5 M) durumlarında büyüyebilmektedir. Bu çalışmanın amacı fizyolojik ve transkriptomik seviyede NaCl stresinin prensiplerini araştırmaktır. S.cerevisiae daha inceki bir çalışmada (Sezgin T., 2010) etil metansulfonat (EMS) ile muamele edilerek mutajenize edildi ve sonra tuz stresine maruz bırakıldı. Mutant bireyler seçilerek tuza karşı nasıl direnç kazandığı yabanıl tip ile karşılaştırılarak araştırıldı. 5 mM LiCl, 0.5 M NaCl, 0.7 M NaCl and 0.9 M NaCl varlığında YMM'de büyütülen yabanıl tip ve T8'in spesifik büyüme eğrileri oluşturuldu. Tüm bu şartlar altında T8 yabanıl tipe göre daha iyi üredi. T8 ve yabanıl tip'e ait olan fenotipik sonuçlar T8'in sodyum ve lityuma karşı olan direncinin belirgin olduğunu ve T8'in potasyum varlığında yabanıl tip ile aynı düzeyde ürediğini göstermiştir. Bu, T8 katyonik toksisiteye karşı dirençliyken osmotik strese karşı direnç göstermemektedir. %25, %30, %35 sorbitol varlığında YMM'de büyütülen T8 ve yabanıl tip karşılaştırıldığında sorbitol varlığında yabanıl tip ve T8'in aynı düzeyde ürediği görülmüştür. T8'in potasyum varlığında da aynı etkiyi gösterdiği görülmiş olup T8'in osmotik strese karşı direnç göstermediğinin kanıtıdır. pH'ın NaCl direncine olan etkisini incelemek üzere T8 ve yabanıl tip değişen NaCl miktarlarında ve farklı pH aralığına sahip YPD'de büyütülmüş. T8'in NaCl olan direncinin pH değişikliklerinden etkilenmediği gözlenmiştir. T8 ve yabanıl tip katyonik ilaçlara olan direnci test edilmiştir. Katyonik ilaç olarak Tetrametilammonyum (TMA) ve spermin seçilmiştir. Katyonik ilaçlar ile direnç testinin sebebi, eğer dirençte bir farklılık var ise, mutantta elektrokimyasal gradient değişikliği oluşmuş olma ihtimalidir. T8 ve yabanıl tip farklı spermin ve TMA miktarlarına sahip olan YPD'de büyütülmüş. T8 ve yabanıl tip'in TMA ve spermin dirençlerinin farklı olmadığı gözlenmiştir. Alevli Atomik Absorpsiyon Spektrometri (AAAS) sonuçları göstermiştir ki, yüksek oranda harici Na+ ve Li+ konsantrasyonları hem T8 hem de yabanıl tipteki hücre içi Na+ miktarını yükseltirken hücre içi K+ oranı düşmektedir. Hücreler toplam tek değerlikli katyon miktarını K+, Na+ and Li+ streslerinden sonra düşük tutmaktadır. NaCl dirençli mutant T8 yabanıl tip ile karşılaştırıldığında belirgin bir şekilde lityum birikmesi görülmemektedir. T8'in lityum direncinin sebebi artmış lityum efflux olmayabilir. Çift stres koşullarında T8 yabanıl tipe göre çok az miktarda Li+ biriktirmiştir. 1 M KCl varlığında yabanıl tip ve T8 karşılaştırıldığında, T8 en yüksek potasyum ve sodyum miktarına sahiptir. T8 LiCl ve NaCl varlığında en yüksek LiCl miktarına sahiptir. AAAS sonuçlarına göre, her stres koşulu altında T8 yabanıl tipe göre yüksek K+/Na+ oranına sahiptir. T8 ve yabanıl tipin K+/Na+ oranları arasındaki fark 5 mM LiCl stresi altında çok belirgindir. LiCl stresinde bu oranın daha fazla olmasının sebebi lityum efflux genlerinin az eksprese olmasından kaynaklı olabilir. Bu durumda T8, NaCl stresindeki gibi LiCl stresinde etkin efflux sistemine sahip olmayabilir. Glikojen ve trehaloz S. cerevisiae'da iki önemli glikoz depolasudur ve bunların üretimi bir çok çevresel stres koşullarına bağlı olarak değişmektedir. Disakkarit trehaloz, tuz adaptasyonunda birikmektedir. Glikojen ve trehaloz miktarının ölçümü sonucunda T8'deki trehaloz ve glikojen miktarı stressiz koşulda göze çarpan bir şekilde yüksektir. Lityum glikojen ve trehaloz miktarını sodyuma göre daha fazla tetiklemektedir. Bu sonuç, lityumun yüksek toksisitesi ile açıklanabilir. Lityum ve sodyumlu stres ve stressiz koşullarda T8'deki trehaloz miktarı glikojene göre daha yüksektir. NaCl ve LiCl varlığında ve yokluğunda T8 ve yabanıl tipin metabolik ürün üretimi Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile incelenmiş. 0.5 M NaCl varlığında T8'in glukoz kullanımının ve etanol üretiminin yabanıl tipe göre daha az olduğu ve en yüksel gliserol üretimine sahip olduğu gözlenmiştir. LiCl varlığında yabanıl tipin glikoz kullanımının belirgin bir şekilde az olduğu ve en yüksek gliserol üretimine sahip olduğu gözlenmiştir. NaCl dirençli evrilmiş S. cerevisiae suşu T8'de, yabanıl tipe göre gliserol ve etanol üretimi daha azalmıştır. Evrilmiş mutantın metabolizması gliserola doğru ve etanol üretiminden uzağa doğru yönlenmiştir. Organizmalar strese karşı korunmak için birçok fizyolojik mekanizmalar kullanılmaktadır. Bu mekanizmalardan birisi çapraz direnç mekanizmasıdır. Bu mekanizmanın amacı bir çevresel faktöre kazanılan direnç sayesinde ikincil strese karşı direnç kazanılmasıdır. fakat, her strese başka bir strese karşı çapraz direnç sağlamamaktadır. YMM ve YPD katı besiyeri ortamında, T8'in LiCl, ZnCl2, H2O2, CoCl2, KCl, etanol, CuCl2, MnCl2, CrCl3, AlCl3 için çapraz direnci incelenmiştir. T8, lityum için yüksek çapraz dirence sahiptir. T8; Co+2, Mn+2 Ni+2, Zn+2'ye az miktarda direnç gösterirken alüminyuma ise hassastır. S. cerevisiae genomu hücre lokalizasyonu, sübstrat spesifikliği ve fizyolojik fonksiyonları açısından birbirlerinden farklılaşan alkali metal katyon/H+ antiporterlarını (Nha1p, Nhx1p, Kha1p) kodlayan 3 gene sahiptir. NHX1, NHA1, ve KHA1 genleri, mutant suşu T8 ile karşılaştırılmak için sekanslanmıştır. Sekanslama sonuçları, EMS ve NaCl stresinin NHX1, NHA1 ve KHA1 gen sekanslarını etkilemediğini göstermiştir. S. cerevisiae'nın yüksek NaCl stresine olan transkripsiyonal cevabı, DNA mikroarray kullanılarak analiz edilmiştir. Mikroarray sonuçlarında, enerji, hücre kurtarma, savunma ve virülans; metabolizma; hücresel transport, transport yolları; hücresel haberleşme/sinyal iletimi mekanizması dahil olmak üzere fonksiyonel kategorileri de içeren NaCl toleransı ile bağlantılı birkaç yüz gen tespit edilmiştir. Mikroarray sonucuna göre, 548 genin ekspresyonu artmış, 22 genin ise ekspresyonu azalmıştır. Hücresel transport ve transport yollarına ait genlerden ise 98 genin ekspresyonu artmışken 32 genin ekspresyonu azalmıştır. Flokülasyon ve biyofilm için gerekli olan GPI-bağlantılı hücre yüzeyi glikoproteini (flokkulin) kodlayan FLO11 geni T8'de en fazla eksprese olan gendir. T8'in microarray sonuçlarında, HOG yolizi indüklenmemiştir. T8 yavaş glukoz alımına sahip olup, yüksek seviyelerde süksinat ve asetat biriktirmemiştir. FLO11 glukoz represyon yolizi ile de kontrol edilmektedir. Bu yolizinde, glukoz heksoz transporterları tarafından besiyerinden hücreye alınır ve hücre içinde glukoz heksokinazlar tarafından glukoz-6-fosfatta fosfatlanır. Bu fosfatlama Snf1 protein kinaz'ı ve Nrg1 inhibitör proteinini de inaktive eder. Bu inaktivasyon FLO11'in regulasyonunu baskılar. Glukoz miktarı az olduğunda Snf1 aktive olarak FLO11 eksprese olur. S.cerevisiae'nin pH değişiklilerine cevabını kontrol eden transkripsiyon faktörü Rim101p hem ENA6 hem de FLO11 ekspresyonunu kontrol etmektedir. T8'de HXT genleri, HXTK1, NRG1, FLO11 ve ENA6 ekspresyonları artmıştır. Bu iki yolizi tarafında T8'in NaCl stresine direnci kontrol edilmesi muhtemeldir. Mikroarray sonucunda T8 indüklenmiş ENA6 ekspresyonuna sahipken, NHA1 indüklenmemiştir. Real-Time PCR sonuçlarında ise ENA6 ve NHA1 genleri indüklenmiştir. Bu sonuçların mikroarray ve real-time PCR arasındaki hassasiyet farklılıklarından kaynaklanması muhtemeldir, zira real-time PCR sonraki daha hassastır. Mikroarray sonuçları T8'in pek çok geninin ortamda NaCl stresi yokken bile ekspresyonunun artmış olduğunu göstermektedir. Ekspresyonu artmış ve azalmış bu genler, T8'i yüksek sodyum ve lityum stresine adapte etmektedir. Nha1 proteini daha fazla üretilmek için klonlanmış ve komplementasyon analizi ile kontrol edilmiştir. Nha1p'nin overekspresyonu göstermiştir ki protein en iyi pH 3.5'te komplement etmektedir. Nha1'e spesifik tek bölge mutasyonları [G372S, D266H, D267A, D266H/D267A, D266N/D267N, N176, D177N], bu mutasyonların pH üzerine olan etkisini anlamak için uygulanmıştır. Bu çalışmada, gliserol üretimi artmış ve etanol üretimi azalmış S.cerevisiae suşlarının, tuz stresine direnç kazandırmaya yönelik evrimsel mühendislik yöntemiyle elde edilebileceği gösterilmiştir. Bu çalışma, EMS ve artan NaCl stres düzeyleri kullanılarak S.cerevisiae seleksiyonu için evrimsel mühendisliğin uygulandığı ilk çalışmadır. Ayrıca bu tez çalışmasının sonuçları, FLO11'in S.cerevisiae'nin yüksek tuz direncinde önemli bi rolü olabileceğine işaret etmektedir.

Özet (Çeviri)

Yeast is an excellent model system for molecular biology, cell morphogenesis, chromosome stability , and even aging. Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7D is widely used for metabolic engineering and systems biology research in industry and academia. A consortium of German yeast researchers developed the isogenic family of CEN.PK strains by crossing different laboratory strains of S.cerevisiae in the 1990s. The haploid MATa strain CEN.PK113-7D, has been extremely popular for studies in systems biology and is a preferred laboratory strain for industrial biotechnology research. Maintenance of alkali cation homeostasis is a key process in most types of cells, including yeasts. Sodium chloride is very important for human biology. Na+ and K+ are essential for human nutrition and also Li+ is an essential nutrient in rodents and goats. The budding yeast S. cerevisiae is able to grow in the presence of a broad range of external concentrations of K+ (10 mM–2.5 M) and Na+ (1.5 M). The aim of this study was to investigate the effects of NaCl stress at physiological and transcriptomic level. S.cerevisiae was first mutagenized by ethyl methanesulfonate (EMS) and then exposed to salt stress (NaCl) by Sezgin T. (2010). An individual was chosen from the population and compared to wild type to investigate how it gained resistance to salt stress. Specific growth curves of wild type and“T8”in YMM were calculated by growing these strains in 5 mM LiCl, 0.5 M NaCl, 0.7 M NaCl and 0.9 M NaCl. In all of these conditions, T8 grew better than the wild type. Spot test results of T8 and wild type (CENPK-7D) showed that resistance to sodium and lithium are obvious, however potassium resistance was not observed. NaCl resistant mutant“T8”was resistant to sodium and lithium, while the wild type as well as T8 grew in the presence of potassium. It couldbe inferred that“T8”had resistance to cation toxicity, but not to osmotic stress. Flame Atomic Absorption Spectrometry (FAAS) results showed that high extracellular Na+ and Li+ concentrations increase intracellular Na+ and decrease intracellular K+ , in both wild type and T8. Apperantly, cells maintain the total monovalent cation content low after K+, Na+ and Li+ stress. NaCl resistant mutant“T8”did not exhibit significantly increased lithium accumulation, compared to the wild type strain. The lithium resistance of the wild type was not caused by increased lithium efflux.“T8”accumulated slightly more Li+ than the wild type in double stress conditions. FAAS results showed that T8 has higher K+/Na+ ratio at every stress condition compared to the wild type. Difference of K+/Na+ ratio between T8 and the wildtype is obvious at 5 mM LiCl. K+/Na+ ratio of T8 was 4.21 and of wildtype was 1.97 at 5 mM LiCl stress. ENA6 and NHA1 genes' expression were lower at LiCl stress, compared to NaCl stress. The reason why K+/Na+ ratio is higher at LiCl stress can be the lower expression of these efflux genes so that T8 may not have active efflux at LiCl stress as at NaCl stress. Glycogen and trehalose are two important glucose stores of the yeast S. cerevisiae, and production of them change in response to a number of environmental stress conditions. The disaccharide trehalose accumulates during salt adaptation. Assessment of glycogen and trehalose content showed that amount of trehalose and glycogen in T8 are prominently high compared to the wild type without stress conditions. Lithium triggers the amount of glycogen and trehalose more than sodium. It could be explained by higher toxicity of lithium. Trehalose accumulation is higher in T8 than glycogen without and with sodium and lithium stress. In our NaCl-resistant evolved S. cerevisiae strain“T8”, production of glycerol is higher and production of ethanol is reduced compared to the wildtype. The metabolism of the evolved strain is redirected toward glycerol and away from ethanol production. The cross-resistance of T8 was assessed by growth on LiCl, ZnCl2, H2O2, CoCl2, KCl, ethanol, CuCl2, MnCl2, CrCl3, AlCl3YPD and YMM plates.T8 has significantly high cross resistance to lithium.T8 has slight resistance to Co+2, Mn+2 Ni+2, Zn+2 and is sensitive to aluminum. The S. cerevisiae genome contains three genes encoding alkali metal cation/H antiporters (Nha1p, Nhx1p, Kha1p) that differ in cell localization, substrate specificity and physiological function. Sequencing of NHX1, NHA1, and KHA1 were checked to be compared with mutant strain“T8”. Sequencing results showed that EMS mutagenesis and NaCl stress did not affect the sequences of NHX1, NHA1, and KHA1 genes. The transcriptional response to high NaCl concentration stress in the yeast S. cerevisiae was analyzed by using DNA microarray to understand yeast strains showing tolerance to high salt stress. In microarray results, several hundred genes were identified associated with NaCl tolerance involving a broad range of functional categories including energy; cell rescue, defense and virulence; metabolism; cellular transport, transport facilities and transport routes; cellular communication/signal transduction mechanism. FLO11 gene encoding GPI-anchored cell surface glycoprotein(flocculin) which is required for flocculation and biofilms was the most highly expressed gene in T8. In“T8”microarray results, HOG pathway is not induced.“T8”had slower glucose uptake and did not accumulate high levels of succinate and acetate. In microarray results,T8 has induced ENA6 expression, however NHA1 is not induced. In Real-time PCR results, both ENA6 and NHA1 genes are induced. This may result from the differences in sensitivities of microarray and real-time PCR, the latter being more sensitive. Microarray results indicated that“T8”has many genes overexpressed compared to the wild type even in the absence of NaCl stress. These upregulated and downregulated genes adapted this mutant to high sodium and lithium stresses. Nha1 was cloned to be overproduced and it is checked by complementation assays. Overexpression of Nha1p showed that this protein complements better at pH 3.5. Specific single site mutations [G372S, D266H, D267A, D266H/D267A, D266N/D267N, N176, D177N ] on Nha1 were applied to understand these influence of this mutations on pH. In this study it was shown that under S. cerevisiae strains with enhanced glycerol and reduced ethanol yields could be obtained by evolutionary engineering for NaCl-stress resistance.This study is the first one that uses EMS and increasing NaCl stress levels for the selection of S. cerevisiae strains by evolutionary engineering. Additionally, the results of this thesis work suggest that FLO11 may have an important role in high NaCl-resistance in S.cerevisiae.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    178136

    Buğdayda (Triticum aestivum L.) absisik asitle ilişkili gen anlatımı

    Abscisic acid related gene expression in wheat (Triticum aestivum L.)

    BİRSEN CEVHER KESKİN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2006

    Bilim ve Teknolojiİstanbul Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ABDÜLREZZAK MEMON

    PROF. DR. AYŞEGÜL TOPAL SARIKAYA

  2. Tez No

    434235

    Sinop ili toprak ve su örneklerinden izole edilen Bacillus türlerinin moleküler karakterizasyonu ve bazı enzim aktivitelerinin belirlenmesi

    Determination of some enzymes activities and molecular characterization of Bacillus species isolated from soil and water samples in Sinop region

    HİLAL KOYUNCU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2016

    BiyolojiSinop Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. HÜLYA SİPAHİ

  3. Tez No

    402989

    Structural studies of the transport cycle of the ABC transporter ABCB1

    Başlık çevirisi yok

    YAPRAK DÖNMEZ ÇAKIL

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    BiyokimyaMedical University of Vienna

    DR. THOMAS STOCKNER

    PROF. DR. PETER CHIBA

  4. Tez No

    184897

    Physiological and genetic characterization of salt tolerance in tomato (lycopersicon esculentum)

    Domates'te (lycopersicon esculentum)tuza dayanıklılığın fizyolojik ve genetik karakterizasyonu

    DENİZ GÖL

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2006

    Biyolojiİzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ANNE FRARY

    YRD. DOÇ. DR. SAMİ DOĞANLAR

  5. Tez No

    416498

    Transformation of tobacco with a nac type transcription factor, TaNAC69-1 and characterization of transgenic plants via molecular and physiological techniques

    Tütünün nac tipi bir transkripsiyon faktörü olan TaNAC69-1 geni ile transformasyonu ve transgenik bitkilerin moleküler ve fizyolojik yöntemlerle karakterize edilmesi

    AYTEN EROĞLU

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYŞE MERAL YÜCEL

    PROF. DR. HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM

Geri Dön