Geri Dön

Molecular recognition based self assembly of engineered proteins on nanoscaled gold surfaces

Nano-ölcek metal yüzeylerde moleküler tanıma esaslı kendiliğinden montaj olabilen protein tasarımı

PDF İndir

  1. Tez No: 405048
  2. Yazar: BANU TAKTAK KARACA
  3. Danışmanlar: PROF. DR. CANDAN TAMERLER, YRD. DOÇ. DR. BÜLENT BALTA
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyokimya, Biyomühendislik, Biyoteknoloji, Biochemistry, Bioengineering, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2015
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 198

Özet

Son zamanlarda, tıp ve teknolojiye yönelik geniş bir uygulama alanında, doğadan esinlenerek geliştirilen yeni malzemeler yoğun bir şekilde araştırılmaktadır. Bu biyolojik malzemelerin çeşitli yapı ve işleve sahip olmalarında rol oynayan anahtar unsurlardan bir tanesi hiyerarşik organizasyondur. Bu organizasyonun çok karmaşık olması nedeniyle söz konusu işlevlerin bire bir aynısının üretilmesi bizim mühendislik yaklaşımlarımızla bile zordur. Moleküler-ölçek tanıma esasına dayalı biyolojik olarak kendiliğinden montaj olabilme ilkesi ise Doğa'nın tasarımındaki anahtardır. Bu mekanizma, biyolojik malzemelerde gördüğümüz kendiliğinden organizasyon ve kendiliğinden düzenlemeyi kolaylaştırmaktadır. Söz konusu mekanizmada rol alan en önemli etkileşim moleküllerinin ise çok yönlü olmalarından dolayı proteinler olduğu anlaşılmıştır. Proteinlerin kendiliğinden montaj olabilme yeteneği gelecekte Doğa'daki tasarımların bire bir benzerlerinin yapılmasında rol oynayabilir. Proteinlerin daha küçük yapıları olan peptidler de Doğa'daki gibi çok yönlülüğe sahip yeni malzemelerin üretilmesinde önemli bileşenlerdir. Son zamanlarda anorganik malzemelere özgün olan peptidler yeni biyo-yüzey fonksiyonlaştırıcı ajan olarak cazip hale gelmişlerdir. Yüzeyleri peptidlerle fonksiyonlaştırma, biyolojik moleküllerin malzeme yüzeyine tutunmasını artırabilmekte ve diğer farklı malzemeler ile de kaplanmasını sağlamaktadır. Peptidlerin bu denli modülerite olmaları onların aynı zamanda çok farklı işlevsel proteinlerle de birleştirilme imkanını sağlamaktadır. Bu çalışmada, güdümlü bir şekilde kendiliğinden organizasyonu gerçekleştirme yeteneğine sahip işlevsel protein ve enzimlerin, peptidlerle olan tasarımı ve rekombinant birleştirilmesine ilişkin detayları sunmaktayız. Bu tez kapsamında, ilk önce, altın yüzeylere biyolojik olarak kendiliğinden montajı başarabilecek MBP-AuBP1 hetero-işlevsel yapı üretebilmek amacıyla, AuBP1 peptidini genetik yollarla iki farklı bağlayıcı kullanarak maltoz bağlayan protein (MBP) ile birleştirdik. Yüzey plazmon rezonans (SPR), lokalize yüzey plazmon rezonans (LSPR) gibi spektroskopik tekniklerle MBP-AuBP1 füzyon proteinin çeşitli altın yüzeylere bağlanma ve kendi kendine tutunma özelliklerini karakterize ederek kanıtladık. Burada AuBP1 peptidi moleküler seviyede anorganik-organik ara yüzeyini etkili bir şekilde kontrol ederek, MBP'nin altın yüzeye uygun bir konformasyonda organizasyonunu sağlamıştır. Dahası softlitografi ve kendiliğinden montaj tekniklerinin kombinasyonu ile AuBP1 peptidi, altın nanoparçacık dizilişlerin (array) üzerine yüksek moleküler yoğunlukta ve bir takım kolay ve tekrarlanabilir adımlardan sonra etkili bir motif oluşturarak proteinin montajını kontrol etmiştir. Bu model sistem spesifik AuBP1 aracılığıyla kat-kat montajlama (layer-by-layer assembly) yeteneğini göstermektedir. İkinci tasarımımızda, altın bağlayan ikinci peptidimiz (AuBP2) ile kırmızı flüoresan protein olan DsRed-monomeri genetik füzyon tekniğiyle birleştirerek yeni, çok fonksiyonlu denetleme molekülü geliştirdik. Biyolojik görüntüleme, ilaç salınımı ve hedefe yönelik tanı mekanizmalarında kullanılmak üzere kendi kendine montajlanan altyapı birimlerinin oluşturulması için AuBP2 özgün bir bağlayıcı malzeme olarak nedeniyle kullanıldı. Ayrıca, AuBP2 peptidi çeşitli nano yüzeylerde fonksiyonel biyo-prob olarak kullanılacak olan altının kullanıldığı malzemelerin tasarımında DsRed'in immobilize olabilmesi için kullanıldı. AuBP2 aracılığıyla çok daha fonksiyonel DsRed-monomer üretilerek hem biyolojik algılama uygulamaları hem de analitik uygulamaları gösterilmiştir. DsRed'in kırmızı fluoresan özelliğinden dolayı fluoresan enerji transfer (FRET) uygulamalarında çok tercih edilmektedir. Çünkü nano ve mikro yüzeylerde çok avantajlı ve güvenilir sonuçlar vermektedir. Bu nedenle bu çalışmamızda kırmızı flüoresan özellikli ve altın yüzeylere immobilize olabilen füzyon protein ürettik. Bununla birlikte DsRed füzyon proteininin bakır metaline bağlanma potansiyelini araştırdık. DsRed'in bakır iyonuna karşı olan bu ilgisi altın nanoparcacıklarla da incelenmiştir. DsRed-AuBP2 bakır iyonu ve altın nanoparcacıklarıyla flüoresan şiddeti azalmaktadır. Bu da bağlanma kinetiği hakkında bilgi vermektedir. Bakır iyonu ve altın nanoparcacıklarının teknolojik önemlerinden dolayı DsRedAuBP2'li biyosensor üretilmiştir. Bununla birlikte DsRed-AuBP2'nin nanofiber oluşumunda da yer alabileceğini gösterdik. Oluşturulan nanofiberler altın nanoparçacığı ve kırmızı flüoresan protein içermektedir. Burada DsRedAuBP2'nin görevi altın nanoparçacıklarının PEO (polietilenoksit) polimeriyle derinlemesine etkileşimini sağlayarak fiber oluşumunun organizasyonunu sağlamaktadır. Böylece çok yönlü ve iletken nanofiberler üretilmiştir. Son olarak altın bağlama aktivesi de olan bir füzyon enzim tasarladık. Format dehidrogenaz (FDH), AuBP2 peptidiyle birleştirildi. Buradaki amaçla elektro katalitik aktiviteyi ölçen devre tasarımında kullanılan bir biyoelektrot üretildi. FDH-AuBP2'nin altın yüzeye immobilize olmasıyla biyoelektrot oluşturuldu ve bu elektrotu enzimin redoks aktivitesinin ölçülebileceği bir elektrik devre tasarımında kullandık. Enzimin format substratını CO2' e dönüştürmesi, tasarlanan elektrik devresinde gözlenmiştir. Geliştirilen çok fonksiyonlu biyomoleküler yapıların kendiliğinden organizasyonu gerçekleştirdiği ve işlevsel hiyerarşik hibrit birimlerin meydana geldiği kanıtlanmıştır. Ayrıca, anorganiklere bağlanan peptidler, enzimlerin yüzeylere oryantasyonunun kontrolünü yapmaktadır. Her bir peptid ve enzim sistemlerinin genetik birleştirmenin ardından kimerik işlevlerin performansını araştırmak için detaylı bir şekilde değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu tezde sunulan tüm bulgular ve sonuçlarla ürettiğimiz proteinleri kullanarak yeni nanoyapılı malzemelerin oluşturulabileceği gösterilmiştir. Tasarladığımız çok fonksiyonlu proteinler altın yüzeylere yüksek affinite ve seçicilikle bağlanabilmektedir. Bundan dolayı protein tabanlı mikro/nano diziler, biyosensörler, biyopiller ve moleküler görüntüleme ve tanımlama sistemlerinde kullanılmıştır. Anorganiklere özgün bağlanan peptidlerin umut verici olan altyapı teknolojisi ve nano yapılı sistemlerdeki rolleri gösterildi. Bu amaçla metallere özgü flüoresan biyosensor, biyolojik pil üretimi için biyolojik elektrot ve iletken nanomat için nanofiber gibi nanoyapılar ürettik. Nano cihazların söz konusu peptid ve proteinlerden tasarlanması gelecekteki yöntemlere umut vadetmesine rağmen hala bir takım araştırılması gereken önemli hususlar vardır. Bu konu üzerinde sınırlı çalışmaların yayınlandığını gördük ve bu amaca yönelik rekombinant olarak, oldukça yüksek oranda üretilebilen, yeni protein yapıların (constructs) tasarlanmasına ilişkin sağlam bir strateji geliştirdik. Dahası, biyoaktif nanoyapılar oluşturmak için protein bileşiklerini kullanarak biyo-nanoteknolojik uygulamalara yönelik bir yaklaşım ileri sürdük. Bu yaklaşım yeni nano cihaz üretimi için anorganiklere özgün bağlanan peptidlerin proteinlerle birleştirilmesidir. Bu üretim sürecinde kendi kendine tutunma tekniğini kullanan ve altına özgün bağlanan (AuBP1 ve AuBP2) peptidleri kullandık. Daha önceki çalışmalarımızda gösterdik ki bu peptidler altın yüzeylere oldukça yüksek bir affinite ve seçicilikle bağlanmaktadır. Sonuçta, bu tez kapsamında geliştirilen proteinlerle yeni nano yapılı malzemelerin tasarlanabildiğini bu çalışmada yer alan bulgular göstermektedir. Geliştirdiğimiz çok işlevli proteinler uygun koşullar altında, nano ölçekten mikro ölçeğe kadar çeşitli altın yüzeylere karşı yüksek bir bağlanma ilgisine ve özgünlüğüne sahiptir. Bu yeni platformlar pek çok amaç için kullanılabilir. Örneğin, protein mikro/nano dizilişler, biyosensörler, biyobateriler ve moleküler görüntüleme ve hedefleme amacıyla kullanılacak belirteçler hazırlanabilir. Belirlediğimiz bu model, organizasyon, kaplama ve mimariyi kontrol edebilen çeşitli protein dizilişleri, plazmon-aktif nanometalik montajlar ve cihazların üretilmesinde tamamen biyolojik bir yol izlemektedir.

Özet (Çeviri)

In recent years, a wealth of novel, nature-inspired materials have been explored across a wide range application in medicine and technology. Hierarchical organization is one of the key components that are reflected in the diverse structure and function in biological materials. In mimicking these functions in our engineering approaches have been challenging due to the complexity of these organization. Biological self-assembly principle based upon precise molecularscale recognition is the key in Nature`s design. Biological machinery facilitates self-organization and self-regulation that we observe in biological materials. Proteins are perceived as crucial interaction components in this machinery owing to their versatile characteristics. The protein assemblies may be the key in making next generation materials mimicking Nature`s design. Peptides as smaller domains of proteins become crucial components in constructing new types of materials having the versatility that we observe in Nature. Inorganic material specific peptides have attracted increasing interest in the recent years as novel bio-surface functionalization agents. Such functionalization can recruit biological cues to the material's surface and promote the otherwise challenging coupling of distinct materials. Their modularity also offers a unique opportunity to link them to numerous other functional proteins. Herein, we provide the details for their design and recombinant incorporation into functional proteins and enzymes to achieve addressable self-organization. In the scope of this dissertation, we first constructed an AuBP1 peptide genetically fused to the C-terminus of maltose-binding protein (MBP) using two different linkers to produce MBP-AuBP1 hetero-functional constructs in order to accomplish the biological self-assembly on gold surfaces. Using various spectroscopic techniques, surface plasmon resonance (SPR), and localized surface plasmon resonance (LSPR), we verified the binding of MBP-AuBP1 fusion protein on gold substrates. The AuBP1 peptide tag were demonstrated to direct the organization of recombinant MBP protein onto various gold surfaces via efficient control of the organic–inorganic interface at the molecular level. Furthermore, using a combination of soft-lithography and self-assembly techniques, AuBP1 peptide tag controlled the formation of protein assemblies onto gold nanoparticle arrays with high molecular packing density and patterning efficiency following a series of simple, reproducible steps. This model system offers layer-by-layer assembly capability upon specific AuBP1. In our second design, we developed multifunctional monitoring molecule through genetic fusion of gold binding peptide (AuBP2) to a red fluorescence protein, DsRed-Monomer. AuBP2 was utilized as a material specific linker to construct novel bio-imaging, drug delivery, and targeting bio-nano hybrid systems. The AuBP2c peptide tag was enabled the self-immobilization of the DsRed protein onto a variety of nanoscale gold surfaces. Functional DsRed monomer generated by protein engineering methods using AuBP2 allowed variety of properties for biological sensing as well as analytical applications. The red emission of DsRed protein offered new opportunities at the nano- to micro-scale of a material surface such as multicolor labeling and fluorescence resonance energy transfer (FRET) applications. Our designed fusion protein with a fluorescent tag provided quick and accurate visualization of the self-immobilized proteins on the gold surface. Additionally, DsRed constructs have a selective and reversible binding affinity to copper. This unique binding property of DsRed protein to copper ions and gold nanoparticles results in tunable quenching of its fluorescence activity. Given the importance of gold nanoparticles and copper ions in several application areas, DsRed-AuBP2 was proposed as a bio-sensing modality through its bi-functional properties, fluorescence and self-assembly. We also tested the efficiency of the DsRed-AuBP2 protein as an integrated component in nanofiber system. The fibers were formed in the presence of the protein provided the integration of gold nanoparticles along the fiber length through Au-binding peptide tag. These nanofibers that feature gold nanoparticles with proteins did not affect the red fluorescence property of the protein, rather protein allowed the visualization of the protein construct along the fibers. Engineering proteins that can decorate gold nanoparticles well integrated into PEO polymer fibers offers several opportunities to create versatile structural templates for metallization in formation of conducting nanofibers. Our final set of design included a fusion enzyme that is designed to have gold binding activity. Formate dehydrogenase, FDH, was fused to an AuBP2 fusion tag to construct FDH-AuBP2. This fusion enzyme was utilized to develop a circuit-based electrode system that provided verification of the redox catalytic ability of the self-immobilized enzyme on gold electrode by subsequent addition of formate. We achieved this validation following the self-immobilization of FDH-AuBP2 onto a gold electrode surface and monitored the conversion of formate to CO2 electrochemically. The circuit-based system we constructed consisted of two gold electrodes submerged in a buffer solution. Prolonged catalytic activity of the enzyme was observed by subsequent addition of format into solution. The engineered multi-functional biomolecular constructs developed were demonstrated to self-organize, forming functional hybrid hierarchical entities. However, no all-encompassing solution exists to control the orientation of the enzymes on surfaces using inorganic binding peptide tags. Each peptide and enzyme system requires detailed evaluation following genetic conjugation to investigate the performance of the chimeric functions. Our results demonstrate the engineered inorganic binding peptides as a promising platform technology by their role in producing bi-hybrid nanostructured systems including fluorescent biosensors for metals, bioelectrodes for biobatteries, and nanofibers for conductive nanomaterial. Based upon an in-depth investigation of the limited research currently published in this growing field, we have developed a strategy for the design of new protein constructs as well as their over-expression as recombinant products. Moreover, we provide a valuable approach to generate bioactive nanostructures for the engineering protein complexes by co-expression, purification, and characterization, coupled with bionanotechnological applications. Our engineering approach to conjugate proteins with inorganic binding peptides to create nanodevices propels this technology forward, one step closer to becoming a reality. Our fabrication process is based upon a bio-enabled self-assembly technique and is, herein, proven capable for engineering multilayered protein and nanometallic assemblies that utilize modular goldbinding peptides, such as AuBP1 and AuBP2. Overall, the reported findings in this dissertation demonstrate a great potential to design novel nanostructured materials that incorporate the engineered proteins that are designed in the scope of this thesis. Our multi-functional engineered proteins display high binding affinity and specificity to various gold surfaces at the nano- to micro scale under ambient conditions. These novel platforms can be used for a variety of purposes such as preparing protein micro/nano-arrays, biosensors, biobatteries, and reagents for molecular imaging and targeting. Our established model constitutes biological routes for biofabrication of various protein arrays, plasmon-active nanometallic assemblies, and devices that feature controlled organization, packing density, and architecture.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    310529

    Constructing peptide (GEPI)-protein molecular hybrids by using genetic engineering methods for materials and medical applications.

    Malzeme ve medikal uygulamalar için gen mühendisliği yoluyla peptid (GEPI)-protein hibritlerin oluşması.

    DENİZ ŞAHİN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2011

    Biyomühendislikİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. CANDAN TAMERLER

    PROF. DR. MEHMET SARIKAYA

  2. Tez No

    332967

    Nano-biotechnological application of inorganic binding proteins

    İnorganiklere özgün bağlanan peptidlerin nano-biyoteknolojik uygulamalari

    SİBEL ÇETİNEL

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2012

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. CANDAN TAMERLER

    PROF. DR. MEHMET SARIKAYA

  3. Tez No

    315327

    Langmuir Blodgett assembly of peptide functionalized nanoparticles onto silicatebased surfaces and their characterization

    Peptit ile fonksiyonlandırılmış nanoparçacıkların Langmuir Blodgett yöntemi ile silika tabanlı yüzey üzerine kaplanması ve karakterizasyonu

    NUR MUSTAFAOĞLU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2012

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Nanobilim ve Nanomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MUSTAFA ÜRGEN

  4. Tez No

    315405

    Specific recognition of a genetically engineered gold binding peptide on gold substrate: İnterfacial charge mechanisms

    Genetik mühendisliğiyle altına bağlanan bir peptitin altın yüzeyini özgül olarak tanımasında arayüzey yük mekanizmalarının incelenmesi

    AYŞE SENEM DONATAN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    Biyofizikİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. CANDAN TAMERLER

    PROF. DR. MUSTAFA ÜRGEN

  5. Tez No

    172074

    Modeling conformational preferences of short polypeptide chains and their interactions with metal oxide surfaces

    Kısa polipeptid zincirlerin konformasyonal tercihlerinin ve metal oksit yüzeylerle etkileşimlerinin modellenmesi

    BAHAR İSMAİLOĞLU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2006

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    DOÇ.DR. CANDAN TAMERLER BEHAR

    Y.DOÇ.DR. CENK SELÇUKİ

Geri Dön