Molecular cloning and characterization of bile salt hydrolase genes (BSH) from Lactobacillus plantarum GD2
Lactobacillus plantarum GD2'den safra tuzu hidrolaz genlerinin (BSH) moleküler klonlanması ve karakterizasyonu
- Tez No: 409074
- Danışmanlar: DOÇ. DR. MEHMET ÖZTÜRK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2015
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Abant İzzet Baysal Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 81
Özet
Safra Tuzu Hidrolaz (BSH) Enzimleri taurin ve glisin bağlı safra tuzlarını aminoasitlere parçalayan enzimlerdir. BSH'ların kesin fonksiyonu halen bilinmezliğini korumakla birlikte; beslenme, kolesterol düşürücü etki ve bağırsak kanserindeki rolü ile ilgili bazı hipotezler geliştirilmiştir. BSH'lar bağırsak florasında bulunan kommensal laktobasiller tarafından da sıklıkla sentezlenirler. Farklı laktobasil suşlarından elde edilen BSH'ların genomik varyasyonları, optimum pH, kinetik özellikler ve substrat seçiciliği gibi farklılıklar gösterdikleri görülmektedir. Bu çalışmada, Lactobacillus plantarum GD2 suşundan elde edilmiş bsh1 geni pET22b ekspresyon vektörüne klonlanmış ve yoğun şekilde ekspres edilmiştir. Gen öncelikle PZR vasıtasıyla türe özgü primerler kullanılarak çoğaltılmış ve sırasıyla pJET1.0 veya pBluescript II SK+ klonlama ve pET22b ekspresyon vektörlerine aktarılmıştır. Klonlar sırasıyla XL1-Blue ve BLR (DE3) Escherichia coli suşlarına aktarılmış, daha sonra 0.1 mM isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside ile indüklenerek ekspres edilmiştir. Yoğun olarak ekspres edilen rekombinant protein, B-PER 6xHis Füzyon Protein Pürifikasyon Kiti kullanılarak saflaştırılmış ve ninhidrin protein analizi yöntemi kullanılarak altı adet farklı konjuge safra tuzu ile dekonjugasyon testi yapılmıştır. bsh1, bsh2, bsh3 ve bsh4 olmak üzere dört gen L. plantarum GD2 suşunun genom dizisinde tanımlanmış ve sekanslanmıştır. bsh1 geninin dizileme sonuçları, daha önceden bilinen diziler ile karşılaştırıldığında; birçok mikroorganizmanın BSH enzimleri ile yüksek oranda homoloji gösterdiği görülmüştür. Saflaştırılmış Bsh1 enziminin biyokimyasal karakterizyonunda enzimde diğer Lactobacillus türlerinde görülmeyen bir takım özellikler ortaya çıkmıştır. Enzim gliko-konjuge safra asitlerini daha yüksek oranda parçalamaktadır ve en yüksek oranda glycodeoxycholic ile aktivite göstermiştir. Bu çalışmada, ileri düzey çalışmalar için Bsh1 enziminin primer yapısının karakterizasyonu ve analizleri yapılmıştır. Gelecekte aktif bölge, substrat bağlanma bölgesi, substrat seçiciliği gibi özelliklerin anlaşılması için, BSH enziminin korunmuş amino asitleri üzerinde yönlendirilmiş mutagenez ve yapısal analizler yapılması gerektiği düşünülmektedir.
Özet (Çeviri)
Bile Salts Hydrolase (BSH) enzymes catalyse the hydrolysis of taurine and glycine-linked bile salts into amino acid residues. The precise function of BSHs is still unknown, but some hypothesis have been proposed about playing role in nutrition, cholesterol lowering and colorectal cancer etc. BSHs are frequently synthesized by intestinal commensal lactobacilli. BSHs from different lactobacilli strains exhibit higher variation in sequence, pH optimum, kinetic properties and substrate specificity. In this study, bsh1 gene from L. plantarum GD2 was cloned into pET22b expression vector and overexpressed. At first; the gene was amplified by PCR using by species specific oligonucleotide primers and then cloned into pJET1.0 or pBluescript II SK+ cloning vector and pET22b expression vector. After clones were transformed to XL1-Blue and BLR(DE3) Escherichia coli host strains respectively, the bsh1 gene was expressed in E.coli BLR(DE3) host by induction of 0.1 mmol 1-1 of isopropylthio galactopyranoside. The overexpressed recombinant protein was purified using B-PER 6xHis Fusion Protein Purification Kit and deconjugation ability of the enzyme was tested with six conjugated bile salts by ninhydrin protein assay. Four genes, bsh1, bsh2, bsh3 and bsh4 were identified in the genome sequence of L. plantarum GD2 and sequenced. Comparison of the deduced amino acid sequences of Bsh1 with previously known sequences revealed high homology with BSH enzymes of several microorganisms. Biochemical characterization of the purified Bsh1 revealed some distinct characteristics not observed in other species of Lactobacillus. The purified Bsh1 enzyme showed preferential activity against glyco-conjugated bile acids and show highest activity against glycodeoxycholic acids. In this study, the primary structure of Bsh1 enzyme was characterized and analysed to further studies. It is thought that site-directed mutagenesis on conserved amino acids of BSH enzyme and structural analysis will be required for the future studies to investigate key residues of the active site, substrate binding pocket and substrate selectivity of BSH enzyme.
Benzer Tezler
- Molecular cloning, expression and characterization of bile salt hydrolase enzymes from Lactobacillus rhamnosus KPB7 and E9
Lactobacillus rhamnosus KPB7 ve E9 suşlarından safra tuzu hidrolaz enzimlerinin moleküler klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu
YEŞİM KAYA
Yüksek Lisans
İngilizce
2015
BiyoteknolojiAbant İzzet Baysal ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MEHMET ÖZTÜRK
- Molecular cloning and characterization of bile salt hydrolase from Lactobacillus fermentum
Lactobacıllus fermentum'dan safra tuzu hidrolazının moleküler klonlanması ve karakterizasyonu
HALKAWT ALI OTHMAN OTHMAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
BiyolojiBolu Abant İzzet Baysal ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MEHMET ÖZTÜRK
- Cloning of bile salt hydrolase gene (BSH) ) from human originated Lactobacillus plantarum and characterization of BSH enzyme by site directed mutagenesis
İnsan kaynaklı Lactobacillus plantarum kökenli safra tuzu hidrolaz (STH) genının klonlanması ve STH enziminin yönlendirilmiş mutagenez ile karakterizasyonu
CANSU ÖNAL
Doktora
İngilizce
2019
BiyolojiBolu Abant İzzet Baysal ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MEHMET ÖZTÜRK
- Molecular cloning, characterization and comparison of bile salt hydrolase enzyme from Lactobacillus gasseri
Lactobacillus gasseri safra tuzu hidrolaz emzimlerinin klonlanması, karakterizasyon ve karşılastırması
NDEYE MAREME BA
Yüksek Lisans
İngilizce
2016
BiyolojiAbant İzzet Baysal ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MEHMET ÖZTÜRK
YRD. DOÇ. DR. YAKUP ERMURAT
- Pamukkale termal sularından izole edilen Bacillus licheniformis'ten katalaz enziminin klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Catalase from a local Bacillus licheniformis species isolated from pamukkale hot springs: Cloning, expression, purification and characterization
MEHMET ÖZKARSLI
