Molecular cloning, expression and characterization of bile salt hydrolase enzymes from Lactobacillus rhamnosus KPB7 and E9
Lactobacillus rhamnosus KPB7 ve E9 suşlarından safra tuzu hidrolaz enzimlerinin moleküler klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu
- Tez No: 409080
- Danışmanlar: DOÇ. DR. MEHMET ÖZTÜRK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Mikrobiyoloji, Biotechnology, Genetics, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2015
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Abant İzzet Baysal Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 100
Özet
Safra tuzu hidrolaz (BSH) enzimi bağırsak florasında bulunan birçok probiyotik bakteri tarafından sentezlenmektedir. BSH pozitif probiyotik bakteriler sahip oldukları bu özellik sayesinde sindirim sisteminin zor koşullarında kolonize olup, safra tuzlarını dekonjuge edebilirler. BSH enzimi konjuge safra tuzlarının hidrolize edilerek dekonjuge safra tuzlarına ve amino asit rezidülerine parçalanma reaksiyonunu katalizlemede sorumludur. Dekonjuge safra asitlerinin vücuttan atılımı ile kolesterolden yeni safra tuzları sentezi yapılması, vücuttaki toplam kolesterol seviyesinin düşmesini sağlamaktadır. Bunun yanı sıra bağırsak florasının birincil safra asitlerini ikincil safra asitlerine (dioksikolik asit ve litokolik asit) dönüştürmesiyle artan toksik sekonder metabolitlere maruz kalan hücrelerde DNA hasarı ve apoptozisin indüklenmesi kolon kanserine yol açar. BSH enzimi birçok türde hatta aynı türlerin farklı suşları arasında dahi polimorfizm göstermektedir. Bu nedenle BSH enziminin yapısı çok iyi bilinmemektedir. Bu çalışmada, BSH enziminin yapı ve fonksiyonunu anlamak için, polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile Lb. rhamnosus KPb7 ve E9 suşlarından bsh gen dizileri çoğaltılmıştır. PZR ürünleri, klonlama vektörü pBluescript'e sokulmuş, DNA sekansı elde edilmiş ve daha sonra ekspresyon vektörü pET22b'ye aktarılmıştır. Rekombinant suşlar Escherichia coli BLR(DE3) suşu kültüründe 0.01 mM isopropyl–β–D–thiogalactopyranoside (IPTG) ile indüklenmiştir. Yüksek oranda ekspres edilen Bsh proteinleri Ni+2 şelatlı kolon kullanılarak pürifiye edilmiştir.Rekombinant Bsh proteinlerinin ekspresyonu sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile teyit edilmiştir. BSH enzim aktiviteleri direk besiyeri ve ninhidrin deneyleri ile ölçülmüştür. Araştırma sonuçları, Lb. rhamnosus KPb7 ve E9 suşlarının glikokonjuge safra tuzlarına (Glikokolik asit, Glikodeoksikolik asit ve Glikokenodeoksikolik asit) karşı aktiviteye sahip olduğunu göstermiştir. Gelecekte BSH enzimlerinin aktif bölgelerindeki anahtar rezidülerini, substrat bağlanma ceplerini ve substrat özgüllüğünü bulmak için iki klonun bsh geni üzerinde yönlendirilmiş mutagenez yapılabilir.
Özet (Çeviri)
Bile salt hydrolase (BSH) enzyme is synthesized from lots of intestinal probiotic bacteria. BSH active probiotics colonize in harsh conditions of the intestinal tract and deconjugate the bile salts due to their BSH activities. BSH enzyme is responsible for catalyzing the hydrolysis reaction of glycine and/or taurine-conjugated bile salts into deconjugated bile salts and amino acid residues. Since free bile acids are excreted from the body, the synthesis of new bile salts from cholesterol can reduce the total cholesterol concentration in the body. On the other hand, increasing of toxic secondary metabolites via bacterial transformation of primary bile acids to secondary bile acids (Deoxycholic acid and Litocholic acid) cause damage on DNA and apoptosis induction which lead to colon cancer. BSH show polymorphism in different species and different strains of the same species. Because of this reason the structure and function is not known very well. In these studies, to understand BSH enzyme structure and function, the bsh genes were amplified from Lb. rhamnosus KPb7 and E9 strains by PCR reaction. PCR products were inserted into pBluescript cloning vector and sequenced and then inserted into pET22b expression vector. Recombinant bsh genes were induced with 0.01 mM of isopropyl–β–D–thiogalactopyranoside (IPTG) in Escherichia coli BLR (DE3) strain. The highly expressed Bsh proteins were purified with Ni2+ chelated column. Expression of recombinant Bsh proteins was confirmed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). BSH enzyme activities were measured with direct plate and ninhydrin assays. Research results represented that Lb. rhamnosus KPb7 and E9 have activity toward glycoconjugated bile salts (Glycocholic acid, Glycodeoxycholic acid and Glycochenodeoxycholic acid). Site-directed mutagenesis can be applied for two clones containing bsh genes to find key residues of the active site, substrate binding pockets and substrate specificity of BSH enzymes in the future.
Benzer Tezler
- Molecular cloning and characterization of bile salt hydrolase genes (BSH) from Lactobacillus plantarum GD2
Lactobacillus plantarum GD2'den safra tuzu hidrolaz genlerinin (BSH) moleküler klonlanması ve karakterizasyonu
YASİN AYDIN
Yüksek Lisans
İngilizce
2015
BiyolojiAbant İzzet Baysal ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MEHMET ÖZTÜRK
- Molecular cloning and characterization of bile salt hydrolase from Lactobacillus fermentum
Lactobacıllus fermentum'dan safra tuzu hidrolazının moleküler klonlanması ve karakterizasyonu
HALKAWT ALI OTHMAN OTHMAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
BiyolojiBolu Abant İzzet Baysal ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MEHMET ÖZTÜRK
- Molecular cloning, characterization and comparison of bile salt hydrolase enzyme from Lactobacillus gasseri
Lactobacillus gasseri safra tuzu hidrolaz emzimlerinin klonlanması, karakterizasyon ve karşılastırması
NDEYE MAREME BA
Yüksek Lisans
İngilizce
2016
BiyolojiAbant İzzet Baysal ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MEHMET ÖZTÜRK
YRD. DOÇ. DR. YAKUP ERMURAT
- Cloning of bile salt hydrolase gene (BSH) ) from human originated Lactobacillus plantarum and characterization of BSH enzyme by site directed mutagenesis
İnsan kaynaklı Lactobacillus plantarum kökenli safra tuzu hidrolaz (STH) genının klonlanması ve STH enziminin yönlendirilmiş mutagenez ile karakterizasyonu
CANSU ÖNAL
Doktora
İngilizce
2019
BiyolojiBolu Abant İzzet Baysal ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MEHMET ÖZTÜRK
- Pamukkale termal sularından izole edilen Bacillus licheniformis'ten katalaz enziminin klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Catalase from a local Bacillus licheniformis species isolated from pamukkale hot springs: Cloning, expression, purification and characterization
MEHMET ÖZKARSLI
