Termofilik Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 rekombinant fosfotriesteraz homolog proteininin mutasyonla bazı özelliklerinin geliştirilmesi
Development of some properties of recombinant phosphotriesterase homology protein obtained from thermophilic geobacillus caldoxylosilyticus TK4 by mutation
- Tez No: 430366
- Danışmanlar: PROF. DR. AHMET ÇOLAK
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyokimya, Genetik, Kimya, Biochemistry, Genetics, Chemistry
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2016
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Karadeniz Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 98
Özet
TÜBİTAK, 109T985 nolu proje kapsamında gerçekleştirilen bu çalışmada, pET-28a(+) vektörüne klonlanmış olan Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 fosfotriesteraz homolog protein geni (TK4PHP) üzerinde bölge spesifik mutasyonlar yapıldı. Elde edilen mutant genler Escherichia coli (E. coli) BL21(DE3)pLysS konakçı hücresinde ekspres edilip, saflaştırıldı. Protein ekspresyonu ve saflaştırma işlemi, SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yapılarak doğrulandı. Aktivite tayini çalışmalarında genel fosfotriesteraz (PTE) substratlarından paraokson, paratiyon ve malatiyon varlığında herhangi bir aktivite elde edilemezken, denenen esteraz substratları içinde en yüksek aktivite p-nitrofenil asetat (pNPA) varlığında gözlendi. TK4PHP rekombinant enzimi, TK4PHPM3-M4 ve TK4PHPM3-M4-M5 mutat enzimleri için optimum pH 8,0 olarak bulunurken, TK4PHPM3 mutantı için bu değer 8,5 olarak belirlendi. Optimum sıcaklık değerlerinin TK4PHP, TK4PHPM3-M4 ve TK4PHPM3-M4-M5 için 50 °C, TK4PHPM3 için ise 60 °C olduğu görüldü. Km ve Vmax değerleri sırasıyla TK4PHP için 1,27 mM ve 7,59 U/mg protein, TK4PHPM3 için 1,43 mM ve 14,53 U/mg protein, TK4PHPM3-M4 için 0,59 mM ve 3,34 U/mg protein, TK4PHPM3-M4-M5 için ise 0,46 mM ve 4,04 U/mg protein olarak hesaplandı. Rekombinant ve mutant PHP'lerin 4 °C'de, pH 3,0-9,0 aralığındaki tamponlarda ayrı ayrı 7 gün inkübe edilmesiyle, aktivitelerini büyük oranda koruduğu gözlendi. Mutant TK4PHPM3-M4-M5 enziminin, 90 °C'de 7 gün inkübasyon sonunda aktivitesini %75 oranında koruduğu belirlendi. Bu sonuçlar, TK4PHP'sine yapılan mutasyonlarla birlikte, oldukça pH ve ısıl kararlı yeni mutant PHP'lerin endüstriyel uygulamalar için önemli potansiyele sahip olabileceğini göstermektedir.
Özet (Çeviri)
In this study, supported by TUBITAK (Project number is 109T985), site specific mutations in the G. caldoxylosilyticus TK4 PHP gene cloned into pET-28a(+) vector was performed, mutant genes were expressed in E. coli BL21(DE3)pLysS and the mutant proteins were purified. Protein expression and purification were confirmed by SDS-PAGE. Whereas the enzyme did not have any activity in the presence of PTE substartes; paraoxon, parathion and malathion, the highest activities were observed with pNPA as an esterase substrate. The optimum pH were determined to be 8,0 for TK4PHP, TK4PHPM3-M4, TK4PHPM3-M4-M5 and 8,5 for TK4PHPM3. The recombinant TK4PHP and the mutant TK4PHPM3-M4, TK4PHPM3-M4-M5 enzymes exhibited optimum activity at 50 °C and TK4PHPM3's activity was optimal at 60 °C. Km and Vmax values were calculated as 1.27 mM and 7.59 U/mg protein for TK4PHP, 1.43 mM and 14.53 U/mg protein for TK4PHPM3, 0.59 mM and 3.34 U/mg protein for TK4PHPM3-M4 and 0.46 mM and 4,04 U/mg protein for TK4PHPM3-M4-M5, respectively. When the enzymes were separately incubated at 4 °C in the buffer solutions (pH ranging from 3,0- 9,0) for 7 days, the activity was mainly retained. The TK4PHPM3-M4-M5 mutant enzyme retained about 75% of its original activity after 7 days of incubation at 90 °C. It is clear from the present results that the enzymes, which are mutated from TK4PHP showing an extremely pH- and thermo- stable esterase activity, might have a very important potential for industrial applications.
Benzer Tezler
- Termofilik Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 suşundan fosfotriesteraz homolog proteinin klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu
Cloning, expression and characterization of phosphotriesterase homology protein from a thermophilic bacterium, Geobacillus caldoxylosilyticus TK4
MELİKE YILDIRIM
- Termofilik Geobacillus caldoxylosilyticus TK4'ten elde edilen rekombinant glukoz izomerazın bazı özelliklerinin mutasyonla geliştirilmesi
Development of some properties of a recombinant glucose isomerase from Geobacillus caldoxylosilyticus Thermophilic by mutation
ÇİĞDEM AYNA
- Termofilik Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 suşundan DNA polimeraz I'in klonlanması ve karakterizasyonu
Cloning and characterization of the dna polymerase I from thermophilic Geobacillus caldoxylosilyticus TK4
CEMAL SANDALLI
Doktora
Türkçe
2007
BiyokimyaKaradeniz Teknik ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ALİ OSMAN BELDÜZ
- Termofilik Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 suşundan alkalin fosfatazın klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu
Cloning, expression and characterization of alkaline phosphatase from thermophilic Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 strain
MELEK ÇOL
- Termofilik Geobacillus caldoxylolyticus TK4 suşundan maltojenik amilaz geninin klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu
Cloning, expression and characterization of a maltogenic amylase of Geobacillus caldoxylolyticus TK4
YAKUP KOLCUOĞLU