Termofilik Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 suşundan DNA polimeraz I'in klonlanması ve karakterizasyonu
Cloning and characterization of the dna polymerase I from thermophilic Geobacillus caldoxylosilyticus TK4
- Tez No: 212027
- Danışmanlar: PROF. DR. ALİ OSMAN BELDÜZ
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyokimya, Biyoloji, Biyoteknoloji, Biochemistry, Biology, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Gca TK4, DNA polimeraz, Mutasyon, Karakterizasyon, Gca TK4, DNA polymerase, Mutant, Characterization
- Yıl: 2007
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Karadeniz Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 133
Özet
Bu çalısmada, Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 (Gca TK4) susundan DNA polimeraz I geni (DNA pol I) klonlandı ve Escherichia coli'de (E. coli) ekspres edilerek bazı biyokimyasal ve fiziksel özellikleri incelendi. Gca TK4 DNA polimeraz I genine ait tüm nükleotit sırası dejenerat primerler ve ters PZR reaksiyonu ile tamamlandı ve genin stop kodonu ile birlikte 2637 bç oldugu belirlendi. Amino asit sırası bakımından diger Bacillus ve Geobacillus DNA polimeraz I enzimlerine %89 benzer oldugu bulundu. 5'3' nükleaz ve polimeraz aktivitesi için korunmus amino asitlere sahip oldugu, 3'5' ekzonükleaz aktivitesi için gerekli korunmus amino asitlere ise sahip olmadıgı belirlendi. Gen pET15b vektörüne klonlanarak, E. coli BL21(DE3)pLysS susunda ekspres edildi ve protein sıcaklık uygulaması DEAE-selüloz ve BioRex 70 katyonik kromatografi ile saflastırıldı. Rekombinant enzimin optimum aktivite gösterdigi sıcaklıgının 55?60 ºC, optimum pH'sının ise 7,5 ile 9,0 arasında oldugu tespit edildi. Enzimin 70 ºC üzerindeki sıcaklıklarda 5 dakika bekletilme sonucu aktivitesini kaybettigi belirlendi. DIG-dUTP'yi normal dNTP gibi kullanarak DNA sentez aktivitesi gösterebildigi ve kalıp/primer kompleksinde, kalıp zincir üzerindeki son nükleotiti ekleyerek 3' ucuna ait boslukları doldurabildigi belirlendi. DNA-bagımlı DNA polimeraz aktivitesi için Mg+2 metal iyonuna (7 mM), RNA-bagımlı DNA polimeraz aktivitesi için Mn+2 metal iyonuna (6 mM) ihtiyaç duymaktadır. Mg+2 ile özgül aktivitesi 495,000 ünite/mg olarak hesaplandı. KDDNA degeri 0,192 nM, KD dNTP degeri ise 21,64 ?M olarak belirlendi. Kpol degeri ise 24,99 s?1 olarak belirlendi. Hem çift zincir DNA hemde tek iplik DNA ile herhangi bir 3'5' ekzonükleaz aktivitesinin olmadıgı, sarkık tek iplik 5' uç tasıyan DNA örnekleri ile 5' nükleaz aktivitesinin KD degerinin 2,35 nM oldugu, enzimin çogunlukla 5' sarkık ucu ve sarkık ucun basladıgı noktada eslesme yapmıs iki nükleotit arasından kesim yaptıgı belirlendi. Gca TK4 DNA pol I yaban tip enzimin ddNTP'ye duyarlı olmadıgı ancak 712 numaralı Fenilalanin amino asiti Tirozin amino asitine dönüstürüldügünde elde edilen mutant enzimin dNTP'ye olan ilgisinin nerede ise tamamen ddNTP'ye dönüstügü belirlendi. Enzimin zincir uzaklastırma aktivitesine sahip oldugu ve 721 numaralı Tirozin amino asiti Fenilalanin amino asitine dönüstürüldügünde ise aktivitenin arttıgı belirlendi.
Özet (Çeviri)
In this study, DNA polymerase I gene (DNAPOL) of a thermophilic Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 (Gca TK4) strain, was cloned and overexpressed in Escherichia coli (E. coli), and then some biochemical and physical properties of the protein were investigated. The whole sequences of DNA pol I gene was determined by degenerate primers and inverse PCR. The gene with stop codon are 2637 bp (878 amino acids). In amino acid level, it has 80? 90% homology to DNA pol gene of Bacillus and Geobacillus. While the enzyme has conserved amino acids for 5? nuclease and polymerase activity, it doesn?t have conserved aminoacids for 3?5? nuclease activity. The gene was cloned into pET15b vector and overexpressed in E. coli BL21(DE3)pLysS strain. The enzyme was purified with heat treatment and chromatography for biochemical characterization. It was found that enzyme shows optimal activity at 55?60°C and pH between 7.5?9.0 (Tris-HCl, 50 mM). Incubation at above 70°C for 5 minutes, it loses its activity above 70°C. Enzeyme can use DIG-dUTP as a regular dNTP and synthetize the DNA. It can also add the last nucleotite on DNA. Enzyme needs Mg+2 (7 mM) ions and Mn+2 (6 mM) ions for DNA-dependent and RNA-dependent DNA polymerase activity respectively. Spesific activity of the enzyme is 495,000 unites/mg with Mg+2 ions. KDDNA and KD dNTP are 0.192 nM and 21.64 ?M respectively. Kpol is 24.99 s- 1. It doesn?t have any 3?5? exonuclease activity with mismatch and single strand DNA. It has 5?3? nuclease activity on 5? overhang DNA with spesific activity of 2,35 nM. It can cut the overhang part of the DNA or between the two match nucleotide at the overhang part. It is not sensitive to ddNTP but when we changed the phenilalanine?712 to tyrosine enzyme mostly recognizes ddNTP instead of dNTP. Enzeyme has strand displacement activity, especially by mutant enzyme with fenilalanine?721 instead of tyrosine721.
Benzer Tezler
- Termofilik Geobacilyus caldoxylolyticus TK4 suşundan glukoz izomeras geninin klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu
Clonning, expression and characterization of glucose isomerase gene from thermophilic Geobacillus caldoxylolyticus TK4 strain
ÖZLEM FAİZ
- Termofilik Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 suşundan alkalin fosfatazın klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu
Cloning, expression and characterization of alkaline phosphatase from thermophilic Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 strain
MELEK ÇOL
- Termofilik Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 suşundan fosfotriesteraz homolog proteinin klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu
Cloning, expression and characterization of phosphotriesterase homology protein from a thermophilic bacterium, Geobacillus caldoxylosilyticus TK4
MELİKE YILDIRIM
- Termofilik Geobacillus caldoxylolyticus TK4 suşundan maltojenik amilaz geninin klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu
Cloning, expression and characterization of a maltogenic amylase of Geobacillus caldoxylolyticus TK4
YAKUP KOLCUOĞLU
- Termofilik Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 rekombinant fosfotriesteraz homolog proteininin mutasyonla bazı özelliklerinin geliştirilmesi
Development of some properties of recombinant phosphotriesterase homology protein obtained from thermophilic geobacillus caldoxylosilyticus TK4 by mutation
FULYA ÖZ
