Geri Dön

Heterotrimeric G-protein alpha (α) subunit from A. thaliana (AtGPA1)) forms trimeric structures in solution

A. thaliana G-proteini alfa (α) altbirimi (AtGPA1) bulunduğu ortamlarda trimerik yapılar oluşturur

PDF İndir

  1. Tez No: 434063
  2. Yazar: ERSOY ÇOLAK
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ZEHRA SAYERS
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyofizik, Biophysics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2016
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Sabancı Üniversitesi
  10. Enstitü: Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 116

Özet

Heterotrimerik guanin nükleotit bağlayıcı proteinler (G-proteinleri) maya, memeliler ve bitkilerde G-protein eşli reseptörler (GPCRs) yardımıyla sinyallerin iyon kanalları, enzimler ve hücre içi ikincil mesajcılar gibi sistemlere iletilmesine aracılık ederler. Alfa (Gα), beta (Gβ) ve gama (Gγ) altbirimleri protein kompleksini oluştururlar. Alfa altbirimi (Gα) hem GTP bağlamak hem de nukleotidin hidrolizinden sorumluyken, beta (Gβ) ve gamma (Gγ) altbirimleri dimerik bir kompleks olarak efektörlerini etkilerler. Memeli protein kompleksinin yapısı ve aktivasyon mekanizması iyi bilinmesine rağmen bu süreçler bitkilerde tam anlamı ile anlaşılamamıştır. Grubumuzda Arabidopsis thaliana ve Oryza sative (Pirinç) heterotrimerik komplekslerinin altbirimleri sırasıyla maya (Pichia pastoris) ve bakteri (E. coli) hücreleri kullanılarak heterolog bir şekilde ifade edilmiştir. Rekombinant proteinler daha sonra biyokimyasal karakterizasyon çalışmaları ve yapısal araştırmalar için saflaştırılmıştır. Bu çalışmaların esas amacı hem in vitro oluşturulmuş kompleks hem de altbirimler üzerinde yapısal çalışmalarla yaparak bitkilerdeki G-protein kompleksinin aktivasyonu ve sinyal ileti mekanizması hakkında bilgi elde etmektir. Bu tez çalışmasında, öncelikli amaç mayadan A. thaliana alfa altbirimi için, GPA1, saflaştırma protokolünün optimizasyonudur. Böylece biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal analizler için yeteri miktarda homojen rekombinant protein elde edilmesi hedef alınmıştır. Bir sonraki adım E.coli'de GPA1 üzerinden N-terminal 36 aminoasit kısaltışmış mutant proteinin (GPA1t) rekombinant üretimidir. GPA1t gösterdiği stabilite dolayısıyla sık olarak yapısal çalışmalarda kullanılmaktadır. Sonuçlar iyileştirilen saflaştırma protokolü ile 0.5 litre P. pastoristen 5.5 mg protein elte ettiğimizi ve daha önceki kullanılan yönteme göre ürünün 5 kat arttığını göstermektedir. GPA1'nın nükleotit (GTP, GDP, GTPγS) bağlaması absorbans spektroskopisi ve dairesel dikroizm spektropolarimetre (CD) ile doğrulanmış bu sonuçlar GPA1'nın ikincil yapısal elementlerinin GTPγS bağladığında proteinin GDP bağlı formundan daha stabil olduğunu göstermiştir. Dinamik ışık saçılımı (DLS) sonuçları ve 'Native-PAGE' analizleri küçük açı X-ışını saçılması (SAXS)' ölçümleri ile bir araya konulduğunda GPA1'nın solüsyon içine trimerik formlar oluşturmaya yatkın olduğu görülmüştür. SAXS ayrıca GPA1-GDP'nin proteinden uzayan esnek bölgelerle birlikte küresel bir yapıya sahip olduğunu göstermektedir. Ayrıca GPA1t geni pQE80-L vektörü kullanarak BL21 hücrelerine klonlanmış ve rekombinant protein izolasyonu için saflaştırma prosedürü geliştirilmiştir. Düşük miktarda protein elde edilmesine karşın, ilk biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonlar yapılmıştır. DLS ölçümleri GPA1 ile karşılaştırıldığında GPA1t'nin daha küçük/kompakt yapıya sahip olduğunu göstermiştir. CD analizlerine göre GPA1t'nin termal stabilitesi GPA1'nınkinden daha yüksektir. Gelecekte yapılacak araştırmaların iki farklı türün (monomer ve trimer) birlikte bulunma durumları ve bunun fizyolojik öneminin araştırılması üzerine olması anlamlı olacaktır. Ayrıca, heterotrimer içindeki GPA1'nın diğer bileşenlerle etkileşiminini anlamak için her iki proteinin modellenmesi önemlidir.

Özet (Çeviri)

The heterotrimeric guanine nucleotide-binding proteins (G-proteins) mediate transmission of signals from G protein coupled receptors (GPCRs) to effector systems including ion channels, enzymes and intracellular second messengers in yeast, mammals, and plants. The complex is comprised of alpha (Gα), beta (Gβ) and gamma (Gγ) subunits; Gα has GTP binding and hydrolysis activity, and Gβ and Gγ interact with downstream effectors as a dimeric complex. Although the structure and activation mechanism for the mammalian complex are well known, these are still not fully understood in plants. In our group subunits of the heterotrimeric complexes from Arabidopsis thaliana and Oryza sativa (rice) are heterologously expressed in yeast and bacteria respectively. The recombinant proteins are then purified for biochemical characterization and structural investigations. Our overall aim is to gain insight into the activation and signaling mechanisms of the G-protein complex in plants through structural studies on the individual subunits as well as the in vitro reconstituted complex. The work in this thesis is undertaken with the primary aim of optimizing the purification protocol of the A. thaliana G subunit, GPA1, expressed in yeast to obtain sufficient quantities of homogeneous recombinant protein for biochemical, biophysical, and structural analyses. A A further goal is the recombinant production of a truncated version of the wild-type GPA1, which lacks the N-terminal 36 amino acids (GPA1t) in E. coli. GPA1t is commonly used in structural studies due to its stability. Results show that the optimized purification procedure has improved the yield to 5.5 mg GPA1 from 0.5 liters P. pastoris culture which represents a fivefold increase compared to earlier results in the group. Nucleotide (GTP, GDP, GTPγS) binding to the recombinant GPA1 is confirmed by absorbance spectroscopy and circular dichroism spectropolorimetry (CD). Results indicate that the secondary structure elements of GPA1 are more stable when it binds GTPγS as compared to GDP-bound form. Dynamic light scattering (DLS) results and Native-PAGE analyses combined with small angle X-ray scattering (SAXS) measurements reveal that GPA1 has a tendency to form trimers in solution. SAXS data also shows that GPA1-GDP has a globular structure with flexible regions extending from the protein. We cloned GPA1t gene in BL21 cells using the pQE80-L vector and a purification procedure was developed for the isolation of the recombinant protein. Despite the low protein yield, preliminary biochemical and biophysical characterizations were carried out on this protein. DLS measurements confirmed the smaller/more compact size of the GPA1t compared to GPA1. According to the CD analyses its thermal stability is higher than that of GPA1. In future studies conditions for the co-existence of the two species (monomer and trimer) and its physiological significance need to be investigated. Moreover, shape models for both species need to be developed to understand AtGPA1 interactions with other components in the heterotrimer.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    392251

    Expression and purification of Arabidopsis thaliana heterotrimeric G protein alpha subunit (GPA1) using bacteria and yeast systems

    A.Thaliana G-proteini alfa altbirimi (GPA1)' ın bakteri ve maya sistemlerinde ekspresyonu ve saflaştırılması

    HAZAL BÜŞRA KÖSE

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2014

    BiyofizikSabancı Üniversitesi

    Biyoloji Bilimleri ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEHRA SAYERS

  2. Tez No

    392268

    Cloning and expression of beta subunit (AGB1) of heterotrimeric G-protein complex from a.thaliana

    A.thaliana heterotrimerik G proteini beta alt birimi(AGB1)nin klonlanmasi ve ekspres edilmesi

    ELİF MOLLAMEHMETOĞLU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    BiyomühendislikSabancı Üniversitesi

    Biyoloji Bilimleri ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEHRA SAYERS

  3. Tez No

    488356

    Investigation of structural properties of heterotrimeric G-proteins γ subunits in plants

    Bitkilerdeki heterotrimerik G proteinlerinin gama alt birimlerinin yapısal özelliklerinin araştırılması

    BİHTER AVŞAR

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    BiyofizikSabancı Üniversitesi

    Biyoloji Bilimleri ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEHRA SAYERS

  4. Tez No

    599718

    Investigation of gαi1 protein homodimerization in live cells using förster resonance energy transfer (FRET) and bimolecular fluorescence complementation assay (BiFC)

    G⍺i1 protein homodimerizasyonun canlı hücrelerde förster rezonans enerji transferi (FRET) ve bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) metotları kullanılarak incelenmesi

    ÖZGE ATAY

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    BiyokimyaOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyokimya Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ DEVRİM SON

    DR. ÖĞR. ÜYESİ SALİH ÖZÇUBUKÇU

  5. Tez No

    139590

    Cloning, characterization and expression of Arabidopsis thaliana G protein alpha subunit gene for structural studies

    Arabidopsis thaliana'daki G protein alfa altbirim geninin yapısal çalışmada kullanılmak üzere klonlanması, karakterizasyonu ve ekspresyonu

    EMİNE SÜPHAN BAKKAL

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2003

    BiyolojiSabancı Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ZEHRA SAYERS

Geri Dön