Investigation of gαi1 protein homodimerization in live cells using förster resonance energy transfer (FRET) and bimolecular fluorescence complementation assay (BiFC)
G⍺i1 protein homodimerizasyonun canlı hücrelerde förster rezonans enerji transferi (FRET) ve bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) metotları kullanılarak incelenmesi
- Tez No: 599718
- Danışmanlar: DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ DEVRİM SON, DR. ÖĞR. ÜYESİ SALİH ÖZÇUBUKÇU
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2019
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyokimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyokimya Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 117
Özet
Heterotrimerik G protein-GPKR etkileşiminin, sinyali efektör proteinlere iletmek için yeterli olduğu klasik GPKR sinyal yolağı, son yirmi yılda bir heterotrimerik G protein-GPKR homo veya hetero-dimer etkileşim modeli ile değişmiştir. Bu çalışmalar, birbirleriyle veya diğer GPKR'ler ile etkileşime giren GPKR'lerin heteromerik G proteinler ile etkileşime girdiğini göstermektedir. Son yıllarda ki araştırmalar, bazı karmaşık sinyal yolakları için GPKR- dimerlerinin, dimerleşmesinin gerekli olduğunu göstermektedir. Bu çalışmalar, dimerlerin dimerizasyonu ile oluşan heterotrimerik tetramerlerin, iki G proteinini, protein-protein etkileşimi için yeterli yakınlığa getirdiğini öne sürmektedir. GPKR'lerden bağımsız olarak G-protein dimerizasyonu veya dimerizasyon için GPCR tetramerizasyonunun gerekli olup olmadığı net değildir. Öte yandan, heterotrimerik G-proteinlerinin G⍺ alt ünitelerinin yapısal homologları olan küçük G-proteinler (Ras ailesi) üzerinde yapılan çalışmalar, dimerizasyonun reseptörlerden bağımsız olabileceğini ve çeşitli sinyal yolları için gerekli olduğunu göstermiştir. Bu çalışma kapsamında G⍺ proteinlerinin homodimerizasyonu, canlı hücrelerde, Bimoleküler Floresan Tamamlama testi (BiFC) ve Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) kullanılarak nitel ve nicel olarak araştırılmıştır. Bunu başarmak için, G⍺i1 protein geni, Gαi1 geninin içinden (G60-Y61, L91-K92 ve A121-E122) , Aequorea victoria' dan elde edilen yeşil floresan geni ve monomerik DsRed geninin türevi olan mCherry floresan proteinleri ile etiketlenmiştir. Bunun yanı sıra, Gαi1 genleri, bimoleküler floresan tamamlama testi için Gαi1 geninin içinden, N-terminal EGFP ve C-terminal EGFP olarak adlandırılan bölünmüş EGFP parçaları ile etiketlenmiştir. Mus musculus Neuroblastoma-2a (N2a) hücrelerine eş transfekte edilen tüm etiketli proteinler ve etkileşimler konfokal floresan mikroskop ile analiz edilmiştir. Bu çalışmanın bulguları, Gαi dimerizasyonu için gerekli moleküler mekanizmaları ve bu proteinlerin dinamiklerini anlamamıza yardımcı olacaktır. Ayrıca, karmaşık sinyal iletimi sırasında çeşitli efektörlerle GPKR etkileşimleri ve Gαi dimerizasyonları sırasında bu reseptörlerin gereksinimi, bu çalışmada optimize edilmiş tekniklerle incelenebilir
Özet (Çeviri)
The classical GPCR signaling pathway, where a heterotrimeric G protein-¬GPCR interaction is sufficient to transmit the signal to effector proteins has been replaced by a heteromeric G protein-¬GPCR homo or heterodimer interaction model over the past two decades. These studies demonstrate that GPCRs that interact with each other couple with a heteromeric G protein. In recent years, evidence suggests that dimer of GPCR dimers is required for some complex signal transductions. In these studies, it was proposed that this heteromeric tetramer formed by the dimerization of the dimers brought two G proteins close enough to each other for protein-¬protein interaction. It is not clear if GPCR tetramerization is required for G-¬protein dimerization or dimerization can occur independent of the GPCRs. On the other hand, studies on small G¬-proteins (Ras family), which are structural homologs of G alpha subunits of heteromeric G-¬proteins, shows that dimerization can be independent of the receptors and necessary for various signaling pathways Within the scope of this study, Gα protein homodimerizations were qualitatively and quantitatively investigated in live cells using Bimolecular Fluorescent Complementation Assay (BiFC) and Förster resonance energy transfer (FRET) methods. To achieve this, the Gαi1 protein gene was labeled with Enhance Green Fluorescent Protein (EGFP) which was derived from Aequorea victoria and mCherry fluorescent protein which is a monomeric derivative of DsRed gene. In addition, the Gαi1 gene was labeled with split EGFP parts which are N-terminus EGFP and C-terminus EGFP for the Bimolecular Fluorescence Complementation Assay. All labeled proteins were co-transfected into Mus musculus Neuroblastoma-2a (N2a) cells and interactions were analyzed via spinning disc confocal microscopy. The findings of this study will help us understand the molecular mechanisms required for Gα dimerization and the dynamics of these proteins. Also, GPCR interactions with various effectors during complex signal transductions and the requirement of these receptors during Gα dimerizations can be studied with the techniques optimized in this study
Benzer Tezler
- Investigation of the effect of GPCR oligomerization on the GNAI1 homodimerization in live cells using FRET
GPKR oligomerizasyonun GNAI1 protein homidimer oluşumunun üzerindeki etkisinin FRET yöntemi ile canlı hücrelerde araştırılması
ENİSE NALLI
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ DEVRİM SON
DR. FATMA KÜÇÜK BALOĞLU
- Farklı kaynaklardan izole edilen CTX-M-15 üreten escherichia coli izolatlarının plazmid replikon tipleri varlığı yönünden incelenmesi
Investigation of the presence of plasmid replicone types among CTX-M-15 producing escherichia coli isolates from different sources
ÇAĞLA AZİZOĞLU
Yüksek Lisans
Türkçe
2020
MikrobiyolojiHatay Mustafa Kemal ÜniversitesiTıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. CEMİL KÜREKCİ
DR. ÖZLEM ÜNALDI
- Investigation of physical interaction between gαi and gαs proteins via FRET in live cells
Gαi ve gαs proteinlerinin fiziksel etkileşimlerinin canlı hücrelerde FRET Metodu ile araştırılması
SEYDA TUĞÇE BALKAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2021
BiyokimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiFen Bilimleri Eğitimi Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ DEVRİM SON
DR. FATMA KÜÇÜK BALOĞLU
- Gα proteini susturulmuş arpa bitkilerinde fizyolojik ve moleküler analizler
Physiological and molecular analyses of plants silenced for Gα protein in barley
BURCU KARAHALİL
Doktora
Türkçe
2018
Genetikİstanbul ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYŞE FİLİZ GÜREL
- Investigation of cloning strategies for A.thaliana G protein α-subunit gene in Pichia pastoris
A.thaliana G-proteini α-alt birimi geninin pichia pastoris'de klonlama yöntemlerinin incelenmesi
BURCU KAPLAN