Termofilik Anoxybacillus flavithermus bakterisinin ısıl kararlı β-glukozidaz geninin klonlanması, ekspresyonu ve biyokimyasal karakterizasyonu
Cloning and expression of Afbgl gene from, Anoxybacillus flavithermus and biochemical characterization of thermophilic β-glucosidase
- Tez No: 434176
- Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. FATİH ŞABAN BERİŞ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biyoteknoloji, Moleküler Tıp, Biology, Biotechnology, Molecular Medicine
- Anahtar Kelimeler: Anoxybacillus flavithermus, β-glukozidaz, termofilik enzim, pNPG, E.coli
- Yıl: 2016
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Recep Tayyip Erdoğan Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 61
Özet
Dünyada bol bulunan ve yenilenebilir enerji kaynağı olan selülozun yıkımında da rol oynayan enzimlerden biri olan β-glukozidazlar (3.2.1.21), oligosakkaritlerin yapısında bulunan β-glukosidik bağların hidrolizinden sorumludur. Bu çalışmada, termofilik Anoxybacillus flavithermus bakterisine ait β-glukozidaz geni PZR ile saptanarak klonlanmış ve E.coli'de eksprese edilerek biyokimyasal karakterizasyonu amaçlanmıştır. Afbgl geni PZR ile yakalanarak Pet100 Directional TOPO Expression kit ile E.coli BL21Star (DE3) hücresinde eksprese edilmiştir. Sonrasında ısı çöktürmesi ve Ni+2 afinite kromatografisi yöntemleriyle saflaştırılmıştır. SDS-PAGE analizinde enzimin 53 kDa olduğu, optimum çalışma sıcaklığının 65ºC, optimum pH'sı 6,8 olarak bulunmuştur. Beta-glukosidaz enziminin substrat spesifikliği pNPG, pNPC, pNPX ve oNPG substratları kullanılarak belirlenmistir. Enzimin substratı olan p-nitrofenil β-glukozid ile yapılan kinetik denemelerde Vmax değerinin β-glukozidaz 5,13 x 105 µmol/dak/mg protein, Km değerinin ise 422,3 µM olduğu belirlenmiştir. Doğada sık karşılaşılan ağır metallerden K, Fe, Mn, Al, Mg, Zn ve Cu'nun saflaştırılmış β-glukosidaz enzim aktivitesi üzerine in vitro etkileri araştırılmıştır. Bu ağır metallerden Mg'un enzim aktivitesi üzerinde aktivasyon etkisi gösterdiği belirlenmistir. Ancak Cu, Zn, Al, Mn, Fe ve K ağır metallerinin ise enzim aktivitesi üzerinde inhibisyon etkisi gösterdiği tespit edilmistir.
Özet (Çeviri)
β-glucosidases (3.2.1.21) hydrolyse celluse which is the most abundant and renewable source of energy on Earth. Also this enzyme completes the hydrolysis by converting cellobiose and cello-oligosaccaharides into glucose monomers. In this study, we aimed to clone, expression, and biochemical characterization of thermophilic β- glucosidase gene from thermophilic bacterium, Anoxybacillus flavithermus. The gene was cloned, sequenced, and expressed in E.coli Afbgl was cloned and overexpressed in E.coli BL21 Star (DE3) host cells with Pet100 Directional TOPO Expession Kit. Then, we purified to homogenity by heat precipitation and Ni+2 affinity chromatography. The molecular mass of the recombinant enzyme was 53 kDa. The optimum temperature and ph of the purified enzyme were 65 ºC and 6,8, respectively. The specifity of beta-glucosidase enzyme was determined used pNPG, pNPC, pNPX and oNPG sustrates. At these points, the enzyme had 5,13 x 105 µmol/dak/mg protein Vmax and 422,3 µM of Km towards p-nitrophenyl β-D-glucoside. The effects of K+, Fe+2, Mn+2,Mg+2, Zn+2, Cu+2 and Al+3, and which are commonly seen heavy metals in the nature on purified beta-glucosidase enzyme was investigated in vitro. It was determined that from this heavy metals Mg+2 has affected as activation on ezyme activity. However, it was determined that the other heavy metals K+, Cu+2, Zn+2, Mn+2, Fe+2 and Al+3have inhbition effects on enzyme activity. Keyword: Anoxybacillus flavithermus, β-glucosidase, thermophilic enzyme, pNPG, E.Coli.
Benzer Tezler
- Anoxybacillus flavithermus bakterisinin ısıl kararlı guanozintrifosfat siklohidrolaz-I geninin klonlanması ve ekspresyonu
Cloning and expression of guanosintriphosphate cyclohydrolase-I from anoxybacillus flavithermus
ÖZLEM HIZAL
Yüksek Lisans
Türkçe
2013
BiyoteknolojiRecep Tayyip Erdoğan ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. FATİH Ş. BERİŞ
- Anoxybacillus flavithermus WK1 AfCDA geninin klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve biyokimyasal karakteriasyonu
Cloning, expression, purification and enzymatic characterization of AfCDA gene from Anoxybacillus flavitheermus WK1
AYŞENUR EMİNOĞLU
Yüksek Lisans
Türkçe
2012
BiyokimyaRecep Tayyip Erdoğan ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. CEMAL SANDALLI
- Termofilik Anoxybacillus flavithermus DSM 2641T bakterisinin ptps geninin klonlanması, ekspresyonu ve enzimin biyokimyasal karakterizasyonu
Cloning and expression of PTPS genefrom thermophilic Anoxybacillus flavithermusdsm 2641T and biochemical characterization of its enzyme
EFSUN ÇELİK
Yüksek Lisans
Türkçe
2018
BiyolojiRecep Tayyip Erdoğan ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. FATİH ŞABAN BERİŞ
- Anoxybacillus gonensis G2T CTP sentetaz geninin klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve amonyak-bağımlı CTP sentetaz aktivitesinin karakterizasyonu
Cloning, expression, purification of ctp synthetase from Anoxybacillus gonensis G2T and characterization of NH3-dependent activity of CTP synthetase
AYŞEGÜL SARAL
- Sıcak su kaynaklarından bakteri izolasyonu, tanımlanması ve Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. Rittmanii'nin b-galaktozidaz enziminin saflaştırılması
Identification, isolation of bacteria from the hot spring and the purification of ß-galactosidase in Alicyclobacillus acidocaldarius subspecies Rittmanii
REYHAN GÜL GÜVEN