Geri Dön

Anoxybacillus gonensis G2T CTP sentetaz geninin klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve amonyak-bağımlı CTP sentetaz aktivitesinin karakterizasyonu

Cloning, expression, purification of ctp synthetase from Anoxybacillus gonensis G2T and characterization of NH3-dependent activity of CTP synthetase

PDF İndir

  1. Tez No: 291795
  2. Yazar: AYŞEGÜL SARAL
  3. Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. CEMAL SANDALLI
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2011
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Rize Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 60

Özet

Sitidin 5'-trifosfat sentetaz (CTPs) primidin metabolizmasında son basamağı katalizleyen enzimdir. CTPs, ATP tarafından aktifleştirilen UTP'ye amino grubunu aktararak CTP oluşumunu katalizler. Nükleotid biyosentezinin bölünen hücrelerdeki öneminden dolayı CTPs anti-tümöral, anti-parazitik ilaçlar için hedeftir. Bu enzimin moleküler ve biyokimyasal özelliklerinin bilinmesi yeni ilaçların geliştirilmesi açısından önemlidir. Bakterilere ve insana ait CTPs yapısal olarak oldukça benzerdir. Bakterilere ait CTPs ile yapılan çalışmalar, insanlara ait CTPs ile yapılacak çalışmalara ışık tutacaktır.Bu çalışmada termofilik Anoxybacillus gonensis G2T (Agon) bakterisinin ctp sentetaz geni (pyrG) ürünü biyokimyasal olarak karakterize edildi ve nükleotid ve amino asit benzerliklerinden yararlanılarak akrabalık dereceleri incelendi. Bu amaç doğrultusunda; (1) Agon genomik DNA'sı izole edildi ve EcoRI enzimi ile oluşturulan genomik kütüphaneden shotgun tekniği kullanılarak pyrG gen sırası bulundu, (2) elde edilen nükleotid diziliminden yararlanılarak hem nükleotid hemde aminoasit verileri kullanılarak benzerlik ağaçları oluşturuldu, (3) pyrG geni pET-15b vektörüne klonlandı ve E. coli (Escherichia coli) BL21 (DE3)pLysS hücrelerine transforme edilerek ekspres edilmesi sağlandı, (4) rekombiant olarak üretilen protein MagneHis Purifikasyon Kiti kullanılarak saflaştırıldı ve sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezinde (SDS-PAGE) saflığı belirlendi (5) pyrG genine ait proteinin biyokimyasal özellikleri spektrofotometrik olarak belirlendi. Sonuç olarak enzimin aktivite gösterdiği optimum sıcaklık 650C ve optimum pH'sının 9 olduğu belirlendi. Enzimin aktivitesinin 650 C ve yukarısındaki ısı uygulamalarında azaldığı bulundu. Km değeri yaklaşık 12,415 mM ve Vmax değeri yaklaşık 0,381 U/L olarak hesaplandı. kcat değeri ise yaklaşık 0,762 s-1 olarak hesaplandı. Benzerlik ağaçlarında ise Agon bakterisinin en fazla Anoxybacillus flavithermus bakterisine benzer olduğu gözlendi.

Özet (Çeviri)

Cytidine 5'-triphosphate synthetase (CTPs) catalyzes the last step in the pyrimidine metabolism. In that reaction, UTP was activated by ATP and used for CTP synthesis by CTPs. Because of the importance of nucleotide biosynthesis in dividing cells, CTPs is a goal for anti-tumor and anti-parasitic drugs. Knowledge of the molecular and biochemical properties of this enzyme is important for the development of new drugs. Cytidine 5'-triphosphate synthetase (CTPs) of bacteria and human are structurally very similar to each other. Studies done with bacteria will shed light on future studies about humans CTPs.In this study, ctp synthetase gene (pyrG) product was biochemically characterized from thermophilic Anoxybacillus gonensis G2T (Agon) and its nucleotid sequence was used to investigate the genetic similarity. For this purpose; (1) genomic DNA was isolated from Agon and cutted by EcoRI enzyme to generate genomic library. pyrG gene sequences was idendified with shotgun method using this library. (2) The genetic similarity was generated by using both nucleotide and amino acid sequences. (3) pyrG gene was cloned into pET-15b expression vector and protein was expressed in E. coli (Escherichia coli) BL21 (DE3)pLysS strain. (4) The recombinant protein was purified with using MagneHis Purification System (Promega) and its purity was proved with sodium-dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). (5) The pure enzyme was biochemically characterized by spectrophotometrically. We found that enzyme has optimum activity at 65 0C and pH:9.0 and it lost its activity after 65 0C. Km and Vmax were calculated approximately 12,415 mM, 0,381 U/L respectively. Kcat value was calculated approximately 0,762 s-1. The similarity trees showed that Agon and Anoxybacillus flavithermus were similar to each order much more than the other species.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    581492

    Anoxybacillus gonensis G2t glukoz izomerazının ısıl kararlılığının K111R-L313I-V101R-A353G/F/W VE T428E/S bölge spesifik mutasyonları ile geliştirilmesi

    Improvement thermal stability of glucose isomerase from Anoxybacillus gonensis g2t by site directed mutagenesis K111R-L313I-V101R-A353G/F/W and T428E/S

    SEYHAN RAKICI

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    BiyokimyaRecep Tayyip Erdoğan Üniversitesi

    Su Ürünleri Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ HAKAN KARAOĞLU

  2. Tez No

    213891

    Anoxybacillus gonensis G2T ksiloz izomeraz geninin klonlanması, gen ürününün saflaştırılması ve karakterizasyonu

    Cloning of anoxybacillus gonensis G2T xylose isomerase gene and purification and characterization of gene product

    DERYA YANMIŞ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2008

    BiyokimyaKaradeniz Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ALİ OSMAN BELDÜZ

  3. Tez No

    856741

    Anoxybacillus gonensis oligo-1,4-1,6-alfa-glukosidaz (sukraz-maltaz-izomaltaz) genin klonlanması, gen ürününün saflaştırılması ve biyokimyasal karakterizasyonu

    Cloning, purification and biochemical characterization of oligo-1,4-1,6-alpha-glucosidase (sucrase-maltase-isomaltase) from Anoxybacillus gonensis

    ZEYNEP DENGİZ BALTA

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    BiyoteknolojiRecep Tayyip Erdoğan Üniversitesi

    Su Ürünleri Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ HAKAN KARAOĞLU

  4. Tez No

    476169

    Anoxybacillus gonensis g2t glukoz izomerasının kinetik ve bazı biyokimyasal parametrelerinin g33d, n138g, t144s, v293ı, v32ı, e373k ve v380ı bölge spesifik mutasyonları ile geliştirilmesi

    Improvoment of kinetic and some biochemical parameters of glucose isomerase from anoxybacillus gonensis g2t by site directed mutagenesis g33d, n138g, t144s, v293i, v32i, e373k and v380i

    PELİN BAK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    Su ÜrünleriRecep Tayyip Erdoğan Üniversitesi

    Su Ürünleri Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. HAKAN KARAOĞLU

    YRD. DOÇ. DR. FATİH ŞABAN BERİŞ

    YRD. DOÇ. DR. DERYA EFE

  5. Tez No

    849106

    Termofilik Anoxybacillus gonensis G2t bakterisinin alfa-amilaz aktivitesinin incelenmesi

    Investigation of alpha-amylase activity of the thermophilic bacterium Anoxybacillus gonensis g2t

    NECMETTİN NAROĞLU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    BiyolojiRecep Tayyip Erdoğan Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. FATİH ŞABAN BERİŞ

Geri Dön