Geri Dön

Site-directed-mutagenesis of metallo-beta-lactamase-like gene of solibacter usitatus

Solibacter usitatus'un metallo-beta-laktamaz benzeri geninin yönlendirilmiş mutagenezi

PDF İndir

  1. Tez No: 439421
  2. Yazar: GÖZDE GÖRGÜLÜ
  3. Danışmanlar: PROF. DR. SEDEF TUNCA GEDİK
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Mikrobiyoloji, Microbiology
  6. Anahtar Kelimeler: β-laktamaz, Metallo-β-laktamaz, Yönlendirilmiş mutagenez, Solibacter usitatus, Fluoribacter gormanii, FEZ proteini, β-lactamase, Metallo-β-lactamase, Site-directed-mutagenesis, Solibacter usitatus, Fluoribacter gormanii, FEZ protein
  7. Yıl: 2016
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Gebze Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 73

Özet

Tıp alanında en sık kullanılan antibiyotik grubu olan β-laktam antibiyotikleri, penisilin bağlayıcı proteinlere spesifik olarak bağlanarak bakteriyel hücre duvarı sentezini inhibe ederler. β-laktam antibiyotiklerine karşı en önemli direnç gelişimi dirençli bakteriler tarafından β-laktamaz enzimlerinin üretimidir. Tor Vergata Üniversitesi'nde (İtalya) yürütülen bir çalışmada, yedi ayrı bakteriden metallo-β-laktamaz (MβL) benzeri proteinler tespit edilmiş, olası genler klonlanmış, ancak hiç birinde β-laktamaz aktivitesi gözlenmemiştir. β-laktamaz aktivitesinin görülmeyişine cevap bulabilmek amacıyla, Fluoribacter gormanii'nin fonksiyonel MβL'si (FEZ) ile yüksek homoloji gösteren Solibacter usitatus metallo-β-laktamaz benzeri proteini (Sol_65) daha detaylı analiz için seçilmiştir. Sol_65 and FEZ proteinlerin üç boyutlu yapılarının birbiriyle örtüştürülmesi sonucunda iki proteinin yapısal farklılıkları ortaya çıkmıştır. Buna göre Sol_65'in aktif bölgesinde yer alan 223. (Asn223: N223) ve 266. (Tyr266: Y266) amino asitlerin yarattığı olası bir sterik engellemenin, β-laktam halkasının aktif bölgeye girişini engelleyebileceği düşünülmüştür. Bunun üzerine, yönlendirilmiş mutagenez ile Sol_65'in 223. ve 266. amino asitlerinin FEZ proteininin aynı pozisyonlarında (223. ve 226.) bulunan amino asitler ile değiştirilmesi ve aynı işlemin FEZ için de yapılması kararlaştırılmıştır. Bu çalışma, hem Sol_65 (N223G) hem de FEZ (G223N) proteinlerinin 223. amino asitinin yönlendirilmiş mutasyonu ile ilgili deney sonuçlarını kapsamaktadır. Öncelikle, amaçlanan mutasyonun Sol_65 proteinine yerleştirilmesi için kalıp bir plazmit (pR_pelBSol65) oluşturulmuştur. FEZ mutasyonu için, daha önce oluşturulmuş olan kalıp plasmid (pET24Fez) kullanılmıştır. Restriksiyon enzim kesimleri ve DNA sekansı ile mutasyonun doğruluğu kanıtlanmış, ancak antibiyotik test sonuçlarına göre rekombinant suşun çok zayıf β-laktamaz aktivitesi gösterdiği bulunmuştur.

Özet (Çeviri)

Beta-lactam (β-lactam) antibiotics, which are the most widely used antibiotic group in medicine, bind specifically to penicillin-binding proteins and inhibit bacterial cell wall synthesis. The most important resistance development against β-lactams is the production of β-lactamase enzymes by resistant bacteria. In a previous work carried out in“University of Tor Vergata (Italia)”, metallo-β-lactamase-like (MβL) proteins from seven environmental bacteria were identified and putative genes were cloned, however no β-lactamase activity was obtained from any of them. Solibacter usitatus MβL-like ORF (Sol_65) has been chosen for further analysis to find an answer for the lack of β-lactamase activity, since its amino acid sequence was highly homologous to the functional MβL of Fluoribacter gormanii (FEZ). Overlapping of the two protein's 3D structures had highlighted the structural differences between Sol_65 and FEZ proteins and it was predicted that amino acids at 223rd (Asn223: N223) and 266th (Tyr266: Y266) positions in the active center of Sol_65 could be responsible for the possible steric hindrance that prevent the entry of the β-lactam ring in the active site. It was decided to change those amino acids with the once present in FEZ at the same sites (223rd and 226th) and vice versa by site directed mutagenesis. Present study covers experimental results of site directed mutagenesis of 223rd amino acid in both Sol_65 (N223G) and FEZ (G223N) proteins. First, a template plasmid to be used in site directed mutagenesis was prepared (pR_pelBSol65) to introduce selected mutation into Sol_65. Template plasmid for FEZ (pET24Fez) was prepared in a previous study. Although, restriction enzyme digestion and DNA sequencing prove that the mutation was successful, the result of the antibiotic test showed that recombinant strain has very poor β-lactamase activity.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    285301

    Site-directed mutagenesis of highly conserved residues in Helix IX of subunit I of cytochrome cbb3 oxidase from Rhodobacter capsulatus

    Rhodobacter capsulatus?ta bulunan cbb3 oksidazın I. alt ünitesinin IX. heliksi üzerindeki oldukça korunmuş rezidülerinin yönlendirilmiş mutagenezi

    ŞÜKRÜYE ER

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    BiyolojiAbant İzzet Baysal Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. MEHMET ÖZTÜRK

  2. Tez No

    439414

    Geobacillus kaustophilus lipaz yapısında bulunan Met287 ve Asp365 rezidülerinin yönlendirilmiş mutagenez yöntemiyle değiştirilmesi, aktivite ve kararlılığına etkilerinin incelenmesi

    Site-directed mutagenesis of the residues Met287 and Asp365 of Geobacillus kaustophilus lipase and the effects of these mutations on the activity and stability

    ATİKE NUR SEYİTOĞLU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2016

    BiyokimyaGebze Teknik Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ALİ TÜRKAN

  3. Tez No

    898771

    Site-directed mutagenesis of Bile Salt Hydrolase (BSH) from Lactobacillus plantarum B14 and substrate specificity analysis of Mutant BSH enzymes

    Lactobacillus plantarum B14'ten Safra Tuzu Hidrolazın (STH) yönlendirilmiş mutajenezi ve mutant BSH enzimlerinin substrat özgüllüğü analizi

    ZEKİYE KILIÇSAYMAZ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    BiyolojiBolu Abant İzzet Baysal Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET ÖZTÜRK

  4. Tez No

    338297

    Deletion mutagenesis of fusarium graminearum NRRL 2903 galactose oxidase in Escherichia coli to study structure-function relations and for prospective biosensor applications

    Fusarium graminearum nrrl 2903 galaktoz oksidazının yapı-işlev ilişkilerinin ve ileriye dönük biyosensör uygulamalarının araştırılması için Escherichia coli'de delesyon mutajenezi çalışmaları

    BURÇAK KOCUKLU

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    BiyolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZÜMRÜT BEGÜM ÖGEL

    PROF. DR. UFUK BÖLÜKBAŞI

  5. Tez No

    688848

    Recombinant production and characterization of serine protease enzyme from Virgibacillus sp. AGTR strain using site directed mutagenesis

    Virgibacillus sp. AGTR suşundan izole edilen serin proteaz enziminin bölgeye yönelik mutagenez yöntemi kullanılarak rekombinant üretimi ve karakterizasyonu

    EVRİM KAPUCU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

Geri Dön