Deletion mutagenesis of fusarium graminearum NRRL 2903 galactose oxidase in Escherichia coli to study structure-function relations and for prospective biosensor applications
Fusarium graminearum nrrl 2903 galaktoz oksidazının yapı-işlev ilişkilerinin ve ileriye dönük biyosensör uygulamalarının araştırılması için Escherichia coli'de delesyon mutajenezi çalışmaları
- Tez No: 338297
- Danışmanlar: PROF. DR. ZÜMRÜT BEGÜM ÖGEL, PROF. DR. UFUK BÖLÜKBAŞI
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoloji, Biyoteknoloji, Genetik, Biology, Biotechnology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: galaktoz oksidaz, otoindüksiyon, pre-peptid, pro-peptid, kendini işleme, alan-hedefli (yönlendirilmiş) mutajenez, delesyon, biyosensör, galactose oxidase, auto-induction, pre-peptide, pro-peptide, self-processing, autoprocessing, site-directed mutagenesis, deletion, biosensor
- Yıl: 2013
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 255
Özet
Fusarium graminearum galaktoz oksidazı (GAO; EC 1.1.3.9); 68kDa, aktif bölgesinde tek bir bakır iyonu içeren alışılmadık bir tiyoeter bağına sahip monomerik ekstraselüler bir enzimdir. Enzim sinyal peptide ek olarak, 17 amino asitlik pro- ve 8 amino asitlik muhtemel pre-peptidden oluşan 25 amino asitlik bir lider peptid ile bir öncü olarak üretilir. Daha önceki çalışmalara dayanarak, bakırın aerobik olarak öncüye in vitro ilavesiyle 17-amino asitlik pro-peptid, aktif bölgedeki tiyoeter bağının oluşmasının öncesinde otokatalitik olarak uzaklaştırılmaktadır. Daha önceki çalışmamızda, GAO?nun pre-pro- öncü formunda E.coli'de heterolog olarak ifade edildiğinde pro-peptidinin kendini işlemesinin gerçekleşmediği ortaya çıkarılmıştır. Bu çalışmada, 8 amino asitlik pre-peptidin E.coli'de heterolog olarak ifade edilen pre-pro-galaktoz oksidazın kendi kendini kesimini engelleyip engellemediği sorusu, 8 amino asitlik pre-peptid alan hedefli mutajenez yoluyla delesyona uğratılarak cevaplanmaya çalışılacaktır. Bu tez çalışmasında, delesyon mutasyonları geliştirmek için plasmid yapıları olarak yönlendirilmiş evrim ile oluşturulan pPre-ProGON1 (N-terminalinde sessiz mutasyonlar ve lider peptidi ile birlikte yaban tipte GAO kodlamaktadır) ve pPre-ProGOMN1 (yerli gao?dan farklı olarak N-terminalinde sessiz mutasyonlar ve işlenmiş enzim kısmında altı mutasyona daha sahip olan, lider peptidi ile birlikte GAO varyantı kodlamaktadır) kullanılmıştır. Pre-peptid delesyonu QuikChange® Alan-Hedefli Mutajenez yaklaşımı ile gerçekleştirilmiş ve DNA dizi analizi ile doğrulanmıştır. Yeni oluşturulmuş pProGON1 ve pProGOMN1 yapıları pET ekspresyon sistemi yoluyla hem IPTG indüklemesi , hem de otoindüksiyonla E. coli BL21 Star (DE3)de ifade edilmiştir. Mutant galaktoz oksidazların farklı afinite kromatografi matriksleri ile saflaştırma denemelerini takiben, pre-delesyona uğrayan galaktoz oksidaz varyantlarının kendini işleme yeteneğini yeniden kazanıp kazanamadığının anlaşılması için SDS-PAGE analizi gerçekleştirilmiştir. SDS-PAGE bantlarının karşılaştırılması pro-peptidin hala N-terminus?ta yer aldığını göstermektedir. Buna göre; GAO aktivitesinin tespiti ve SDS-PAGE?den elde edilen moleküler ağırlık da aktif bölgede tiyoeter bağının uygun bir biçimde oluşumunda pro-peptidin zararlı bir etkiye sahip olmadığına işaret etmektedir. Bununla birlikte, Pro-GAO ve Pre-Pro-GAO'ların spesifik aktiviteleri MatGOMN6dan sırasıyla c.13 kat ve c.1,8 kat daha düşüktür, ki bu aktif bölge konformasyonunda pre-peptidin etkisine dikkat çekmektedir. Buna ilaveten, E.coli'de pro-peptidin kendini işlemesinin engellenmesi N-terminus?taki pre-peptid varlığından kaynaklanmamaktadır. Üstelik, bu keşif galaktoz oksidazın kendi kendini keserek olgunlaşmasının yalnızca oksijen ve bakıra bağlı değil, ancak kendi kendine kesimi engelleyen post-translasyonal modifikasyonlar gibi E.coli'de var olan ya da olmayan başka bir mekanizmaya da bağlı olabileceğinin altını çizmektedir. Ayrıca, bu çalışmayla pro-peptid kesiminin galaktoz oksidazın primer amino asit sekansından bağımsız olduğu da gösterilmiştir. Çalışmanın ikinci kısmında, yeni geliştirilen biyosensör uygulamaları için MatGOMN6 olarak adlandırılan işlenmiş galaktoz oksidaz varyantında (yerli gao'dan farklı olarak N-terminalinde sessiz mutasyonlar ve işlenmiş enzim kısmında altı mutasyona daha sahip) domain delesyonları amaçlanmıştır. İşlenmiş GAO kodlayan yapı üzerinde (pMatGOMN6), downstream prosesleri kolaylaştırmak için Strep-tag yerine His-tag değişimi başarılı bir şekilde gerçekleştirildikten sonra yukarıda özetlendiği üzere; her iki türevi üzerinde de domain I/II ve domain III için delesyon ve ekspresyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Daha ileri optimizasyon ve saflaştırma çalışmaları başka bir projenin parçası olarak devam etmektedir.
Özet (Çeviri)
Galactose oxidase (GAO; EC 1.1.3.9) from Fusarium graminearum; is a 68kDa, monomeric extracellular enzyme having an unusual thioether bond with a single copper ion at its active site. The enzyme is produced as a precursor with a 25 amino-acid leader peptide, consisting of a 17-amino acid pro- and an 8-amino acid putative pre-peptide, in addition to a signal peptide. Based on previous studies, the 17-amino acid pro-peptide is removed autocatalytically by the aerobic addition of Cu2+ to the precursor in vitro, preceding the formation of the thioether bond at the active site. In our previous study, it was discovered that self-processing of the pro-peptide did not take place when GAO was expressed heterologously in E.coli in its pre-pro- precursor form. In this study, the question whether the 8-amino acid pre-peptide is hindering the self- cleavage of heterologously expressed pre-pro-galactose oxidase in E.coli is tried to be answered by deleting the 8 amino-acid pre-peptide via site-directed mutagenesis. pPre-ProGON1 (encoding wild- type GAO together with the leader peptide with N-terminal silent mutations) and pPre-ProGOMN1 (encoding a variant of GAO together with the leader peptide, with silent mutations at the N-terminus different from native gao and six further mutations within the mature enzyme) which were developed by directed evolution, were used as the plasmid constructs in developing deletion mutations in this thesis study. The pre-peptide deletion was carried out by QuikChange® Site-Directed Mutagenesis approach and confirmed by DNA sequencing. The newly generated pProGON1 and pProGOMN1 constructs were expressed in E. coli BL21 Star (DE3) through pET expression system either by IPTG induction or by auto-induction. Following purification trials of mutant galactose oxidases by different affinity chromatography matrices, SDS-PAGE analysis was performed to figure out whether the pre-deleted galactose oxidase variants recover the ability of self-processing. Comparison of the SDS-PAGE bands substantiated that the pro-peptide is still present at the N-terminus. Accordingly; detection of GAO activity and molecular weight derived from SDS-PAGE also indicated that pro-peptide has no detrimental effect on the proper thioether bond formation at the active site.However, specific activities of Pro-GAOs and Pre-Pro-GAOs are c.13 fold and c.1,8 fold lower than MatGOMN6, respectively, indicating pre-peptide effect on active site conformation. In addition, the prevention of the autoprocessing of the pro-peptide is not due to the presence of the pre-peptide at the N-terminus in E.coli. Moreover, this discovery underlines that the self-catalytic maturation of the galactose oxidase may not be only copper and oxygen dependent but any other mechanism present or absent in E.coli such as posttranslational modifications prevents autoprocessing. It also appears from this study that pro-peptide self-cleavage is independent of the primary amino acid sequence of GAO. On the second part of this study, domain deletions of a variant of mature galactose oxidase, namely MatGOMN6 (with silent mutations at the N-terminus different from native gao and six further mutations within the mature enzyme), were aimed for novel biosensor applications. After His-tag had been substituted for Strep-tag successfully on the construct encoding mature GAO (pMatGOMN6), in order to facilitate downstream processes, deletion and expression studies of domain I/II and domain III were carried out on both derivatives as outlined above. Further optimization and purification studies are underway as a part of another project.
Benzer Tezler
- Recombinant production and characterization of serine protease enzyme from Virgibacillus sp. AGTR strain using site directed mutagenesis
Virgibacillus sp. AGTR suşundan izole edilen serin proteaz enziminin bölgeye yönelik mutagenez yöntemi kullanılarak rekombinant üretimi ve karakterizasyonu
EVRİM KAPUCU
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
Biyokimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
- Characterization of NFI transcription factors, NFIB targets and miRNAs that regulate NFIB in human neural stem cells
İnsan nöral kök hücrelerinde NFI transkripsiyon faktörlerinn, NFIB hedef genlerinin ve NFIB ekspresyonunu düzenleyen miRNA'ların karakterizasyonu
GÖKÇE CESUR
Yüksek Lisans
İngilizce
2015
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- Deletion mutation of GlnB and GlnK genes in rhodobacter capsulatus to enhance biohydrogen production
Rhodobacter capsulatus?da biyohidrojen üretiminin arttırılması amacıyla GlnB ve GlnK genlerinin etkisizleştirilmesi
GÜLŞAH PEKGÖZ
Yüksek Lisans
İngilizce
2010
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Bölümü
PROF. DR. UFUK GÜNDÜZ
PROF. DR. İNCİ EROĞLU
- Mutagenesis on the aspergillus oryzae alpha-amylase gene promoter
Aspergillus oryzae alfa amilaz gen promotöründe yapılan mutasyon çalışmaları
ORKUN BAŞARIR
Yüksek Lisans
İngilizce
1998
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ZÜMRÜT ÖGEL
- Akut myelositik lösemide mitokondriyal DNA değişimleri
Mitochondrial DNA alterations in acute myelocytic leukemia
KHALİD AL GHODRAN