Inverse metabolic engineering of propolis-resistant Saccharomyces cerevisiae
Tersine metabolik mühendislik yaklaşımıyla propolise dirençli Saccharomyces cerevisiae eldesi
- Tez No: 439601
- Danışmanlar: PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2016
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 97
Özet
Propolis, bal arılarının kovanlarını inşa etmek ve funguslar ile bakterilere karşı kovanlarını korumak için bitki ve ağaçlardan toplayarak oluşturdukları reçineli bir bileşiktir. Propolis, yapısında bulunan üçyüzden fazla bileşen ile karmaşık bir kimyasal içeriğe sahiptir. Bu bileşenler polifenoller, fenolik aldehitler, kumarinler, aminoasitler, steroid ve inorganik bileşenler olarak sıralanabilir. Propolisin antimikrobiyal aktivite, antitümör aktivitesi, antioksidant aktivite, antiinflamatuar aktivite, sitotoksik aktivite ve terapötik aktivite gibi biyolojik aktivitelere sahip olması, onu ilgi çekici bir bileşik haline getirmiştir. Saccharomyces cerevisiae ökaryotik bir maya hücresidir ve fungus alemine aittir. S.cerevisiae hücrelerinin kültivasyonu ucuz ve kolaydır. Temel besin kaynakları hücre üremesi için yeterlidir. Gelişme ortamı temel besin kaynaklarını içeriyorsa, bakteri kadar hızlı gelişebilirler. Hücre yapıları hayvan ve bitki hücresi gibi kompleks yapılara benzerdir. Tüm bu sebeplerden dolayı S.cerevisiae bilimsel çalışmalarda ökaryotik model organizma olarak kullanılmaktadır. Bu tez çalışmasında tersine metabolik mühendislik yaklaşımıyla, propolise dirençli S. cerevisiae mayası elde edilerek fizyolojik açıdan incelenmiştir. Bu amaçla, öncelikle referans suş ve EMS ile rastgele kimyasal mutasyona uğratılmış S.cerevisiae suşu farklı konsantrasyonlarda propolis içeren ortamlarda büyümeye bırakılarak inhibe edici propolis konsantrasyonu ve seleksiyon deneylerinde kullanılacak propolis konsantrasyonu belirlenmiştir. Seçilen 12 mutant koloni, son popülasyon ve referans suşun propolis direncini belirlemek için öncelikle damlatma (spot) testleri gerçekleştirilmiştir. Damlatma test sonuçlarına göre, 12 mutant koloni arasından, en dirençli gözlenen 5 farklı koloni (FD7, FD8, FD10, FD11, FD12) seçilmiştir. Seçilen beş mutant bireyin propolis stresine olan direncini gözlemlemek amacıyla Most Probable Number (MPN) testi uygulanmıştır.Çapraz direnç testinde ise propolise direnç geliştirmiş olan mutant bireylerin başka hangi stress türlerine de direnç kazandığı incelenerek karşılaştırma yapılmıştır.Genetik kararlılık testinde propolise karşı yüksek direnç gösteren FD10 ve FD11 mutant kolonilerinin propolise olan dirençlerinin kalıcı olup olmadığı araştırılmıştır. FD11 suşunun üreme eğrilerinin eldesi için öncelikle doz tarama deneyi uygulanmış ve deney sonuçlarına göre 200 µg/mL propolis konsantrasyonu referans suş ve FD11 mutantı için uygun propolis konsantrasyonu olarak belirlenmiştir. Üreme eğrisi deneyleri 200 µg/mL propolis içeren ve içermeyen (kontrol) besiyeri ortamlarında gerçekleştirilmiştir. Referans suş ve FD11'in 200 µg/mL propolis varlığında ve propolissiz ortamdaki optik yoğunluklarının 600 nanometre dalgaboyunda düzenli aralıklarla ölçümü ile üreme eğrileri elde edilip, birbiriyle kıyaslanmıştır. Üreme analizi sonunda, hücre kuru ağırlıkları da ölçülüp kıyaslanmıştır. Ayrıca; tüketilen glukoz, üretilen gliserol, asetat ve etanol gibi metabolitlerin miktarı yüksek basınçlı sıvı kromotografisi (HPLC) cihazı ile belirlenmiştir. Depo karbonhidratlarından trehaloz ve glikojen miktarları, enzimatik bir yöntem yardımıyla hesaplanmıştır. Son olarak, hücre içindeki oksidasyon düzeyleri reaktif oksijen deneyi ile saptanmıştır. Tüm bu çalışmalar referans suş ile propolise dirençli mutant suşun fizyolojik farklılıklarını belirlemek amacıyla yapılmıştır. Sonuç olarak, bu çalışmada propolise yüksek düzeyde direnç gösteren ve genetik açıdan kararlı bir S. cerevisiae mutant suşu elde edilmiştir. Yapılan fizyolojik analizler, mutant suşun kafein ve NiCl2 streslerine karşı çapraz direnç gösterdiğini ve hücre içi ROS düzeylerinin referans suşa kıyasla daha düşük olduğunu göstermiştir. Yapılacak genomik, transkriptomik ve proteomik analizler, S. cerevisiae'de propolis direnç ve tepkisinin moleküler altyapısının anlaşılmasına katkı sağlayabilecektir.
Özet (Çeviri)
Propolis is a resinous, sticky and dark colored substance that bees produce by mixing their own waxes with resins obtained from plants. Propolis has various biological activities such as antimicrobial activity, antitumor activity, antioxidant activity, antiinflammatory activity, immunomodulator, cytotoxic and therapeutic activity. S. cerevisiae is a eukaryotic organism, also named as baker's yeast or budding yeast. S. cerevisiae cells are mainly oval-shaped but cell size varies between 10 µm long and 5 µm wide, according to environmental conditions.Culturing S. cerevisiae cells is easy and inexpensive. Basic nutritional sources are enough for cell growth. In the present study, propolis-resistant S.cerevisiae population was obtained under gradually increasing propolis stress levels, by using an inverse metabolic engineering strategy. Reference strain(905) and its mutagenised form (906) were screened under increasing propolis stress levels to determine the initial stress level for selection. 150 µg/ml propolis was chosen as the initial propolis level and it was increased by 10 µg/ml at each step during selection. Totally, 57 mutant populations were obtained and their survival rates decreased, when propolis levels were increased. EMS mutagenised population (906) gained resistance and showed growth even at 710 µg/ml propolis concentration. The final population was incubated on solid YMM plates and twelve individual mutant colonies were chosen randomly. These propolis-resistant colonies were tested for their propolis-resistance, using spot assay and MPN method. Cross-resistance tests were applied to propolis-resistant mutants to determine their potential resistance against other stress types. The genetic stability analyses were performed using FD10 and FD11 mutants, to test if their resistance is permanent or not. It was shown that the mutants tested were genetically stable. At last, growth curves and cell dry weight measurements of FD11 mutant and the reference strain were obtained and compared to each other. HPLC analysis was used to determine concentrations of important metabolites, such as residual glucose, glycerol, acetate and ethanol.Trehalose and glycogen levels were measured by an enzymatic assay. Finally, reactive oxygen species were detected by ROS assay for both reference strain and FD11, with and without propolis stress. To conclude, a highly propolis-resistant and genetically stable S. cerevisiae mutant was obtained in this study. Physiological analyses revealed that the mutant was cross-resistant against caffeine and NiCl2 stress and has lower levels of ROS generation. Future genomic, transcriptomic and proteomic analyses may help understand the molecular basis of propolis resistance and response in S. cerevisiae.
Benzer Tezler
- Inverse metabolic engineering of aluminium-resistant Saccharomyces cerevisiae
Tersine metabolik mühendislik yöntemi ile aluminyuma dirençli Saccharomyces cerevisiae eldesi
NACİYE DURMUŞ İŞLEYEN
Yüksek Lisans
İngilizce
2015
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Investigation of antimicrobial resistance in wild-type and stress-resistant Saccharomyces cerevisiae strains
Yaban-tip ve strese dirençli Saccharomyces cerevisiae suşlarında antimikrobiyal dirençliliğinin incelenmesi
RIZIQ NAHIDH ISMAEEL ALSAMAWI
Yüksek Lisans
İngilizce
2018
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Inverse metabolic engineering and molecular characterization of caffeine-resistant saccharomcyes cerevisiae
Kafeine dirençli saccharomcyes cerevisiae'nin tersine metabolik mühendislik ile eldesi ve moleküler karakterizasyonu
YUSUF SÜRMELİ
Doktora
İngilizce
2020
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Evolutionary engineering of rapamycin-resistant yeast
Evrimsel mühendislikle rapamisine dirençli maya eldesi
ÖMER ESEN
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Evolutionary engineering and physiological analysis of antimycin-a resistant Saccharomyces cerevisiae
Antimisin-a dirençli Saccharomyces cerevisiae'nin evrimsel mühendisliği ve fizyolojik analizi
ALİCAN TOPALOĞLU
Yüksek Lisans
İngilizce
2018
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR