Evolutionary engineering of rapamycin-resistant yeast
Evrimsel mühendislikle rapamisine dirençli maya eldesi
- Tez No: 770931
- Danışmanlar: PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Mikrobiyoloji, Biotechnology, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 75
Özet
Saccharomyces cerevisiae, tomurcuklanan bir maya türü olup; gerek fırıncılık, alkol fermentasyonu, biyoyakıt ve rekombinant protein üretimi gibi pek çok endüstriyel süreçte, gerekse de ökaryotik bir mikroorganizma olması nedeniyle insanın da dahil olduğu ileri ökaryotik organizmaların karmaşık biyolojik süreçlerini anlayabilmek için yapılan temel araştırmalarda bir model organizma olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır. Model organizma olarak kullanılmasının ana sebepleri, S. cerevisiae'nin iyi karakterize edilmiş genomu ve proteomu olması, büyüme ve manipülasyon kolaylığı ve ayrıca genlerinin ve yolaklarının daha yüksek organizmalara benzerliğidir. S. cerevisiae mayası, endüstriyel üretim koşullarında çeşitli stres türlerine maruz kalır. Bunlar açlık (besin kısıtlılığı), oksidatif stres, donma-erime stresi, ozmotik stres veya tuz stresi gibi çeşitli streslerdir. Bu tip çoklu stres türlerine dirençli mayaların elde edilmesi ve stres tepkisi ile stres direncine neden olan moleküler faktörlerin belirlenmesi önem arz etmektedir. S. cerevisiae, çevresel değişikliklere ve streslere karşı çeşitli hücresel yanıtlar vererek, homeostazını yani hücresel dengesini yeniden kazanmak için hücresel yolaklarında değişiklikler yapar. S. cerevisiae'de stres yanıt elementleri (STRE) olarak adlandırılan yaklaşık 900 genin, çeşitli düzensizlikler üzerine çevresel stres yanıtına dahil olduğu gösterilmiştir. Bu bulgular, stres tepkisi ile stres direncinin moleküler altyapısının son derece karmaşık olduğunu göstermektedir. Mayada ve ileri ökaryotlarda stres tepkisi ve direncinin moleküler mekanizmaları, henüz tam anlamıyla aydınlatılamamış olduğu için halen üzerinde çalışılmakta olan, karmaşık ancak güncel bir konudur. Rapamisin, Streptomyces hygroscopicus bakterisi tarafından üretilen bir makrolid bileşiktir. Tıp alanında, rapamisin ve analogları organ nakli reddini önlemek, koroner stentleri kaplamak ve tümör hücrelerini tedavi etmek için kullanılır. S. cerevisiae'de ve ayrıca diğer yüksek ökaryotlarda hücre büyümesi ve ömrü, protein sentezi ve ribozom biyogenezi, hücre döngüsü ve boyutunun düzenlenmesi, çevresel stres tepkisi, besin alımı, açlık kontrolü ve otofaji gibi birçok önemli metabolik yolak, rapamisinin TOR inhibisyonu nedeniyle etkilenir. Fkbp12, rapamisin ile kompleks oluşturarak mekanizması henüz bilinmeyen bir şekilde TOR'u inhibe eder. İmmünofilin olan Fkbp12, mayalardan memelilere kadar ökaryotlar arasında yapısı ve işlevi bakımından değişiklik göstermez. S. cerevisiae'de bulunan Fpr1, insanlarda bulunan Fkbp12'nin bir ortologudur. S. cerevisiae mayasında, iki ayrı gen (TOR1 ve TOR2) iki ayrı TOR kompleksi kodlamaktadır, memeli TOR kompleksi (mTORC1 ve mTORC2) ise tek bir gen ile kodlanmaktadır. TOR, hem mayalarda hem de memelilerde Ser/Thr protein kinaz aktivitesine sahiptir. Bu organizmalar, ayrıca TOR fonksiyonu için önemli olan Ser1972/1975, Trp2042 and Phe2049 rezidülerini de korumuştur. Rapamisin, maya hücrelerinde retrograd sinyalleme yolağıyla amino asit biyosentezini etkiler ve bu da belirli amino asitlerin (çoğunlukla glutamin ve glutamat) üretiminin artmasına neden olur. TOR'un inhibisyonu, S. cerevisiae'de özellikle Msn2/4 ve Rim15'in etkinleştirilmesi yolağıyla Çevresel Stres Yanıtı (ESR) yolaklarını etkinleştirir. TOR ve Msn2/4 gibi faktörlerin S. cerevisiae'nin ısı, oksidatif stres ve tuz stresi tepkisine dair genleriyle ilişkili olduğu da belirlenmiştir. Benzer şekilde, rapamisinin ve TOR inhibisyonunun, hücre duvarının bütünlüğünün korunması ile ilgili metabolik yolağı da aktive ettiği gösterilmiştir. Bu çalışmada, rapamisin stresine dayanıklı S. cerevisiae suşları elde etmek için, tersine metabolik mühendislik yaklaşımı olan evrimsel mühendislik kullanılmıştır. Bu doğrultuda, kademeli olarak artan rapamisin stresi altında S. cerevisiae CEN.PK113-7D referans suşuna kesikli kültürlerde seleksiyon uygulanmıştır. Seleksiyondan önce tarama deneyi yapılarak, başlangıç stres seviyesi 3 ng/ml rapamisin stresi olarak belirlendi. Seleksiyon sırasında, ortamdaki rapamisin konsantrasyonu, 61 günlük pasaj veya popülasyonda kademeli olarak 3 ng/ml'den 200 ng/ml'ye çıkarıldı. Nihai popülasyondan, R1 ila R15 olarak adlandırılan on beş bireysel koloni rastgele seçildi. Her birey (R1 ila R15), referans suşa (905) kıyasla rapamisin stresine karşı oldukça dirençli bulundu. Sonrasında, R1, R3, R7, R12 ve R14 genetik kararlılık testine devam etmek üzere seçildi ve genetik olarak kararlı oldukları bulundu. Böylelikle rapamisine karşı dirençlerinin kalıcı olduğu gösterildi. Genetik olarak kararlı suşlar, 0.5 mM NiCl2, 2.5 mM CrCl3, 3 mM CoCl2, 17.5 mM MnCl2, 50 mM NH4Fe(SO4)2, 10 mM AlCl3, 20 mM CuCl2, 15 mM LiCl, 50 mM H3BO4, 100 µM AgNO3, 0.5 M NaCl, 15 mM kafein, 4 mM vanilin, 200 ng/ml propolis, 1mM koniferil aldehit ve 200 ng/ml sikloheksimit dahil olmak üzere çeşitli stres türlerine karşı çapraz dirençleri veya hassasiyetleri için damlatma testine (spot assay) tabi tutuldu. R12'nin en yüksek sayıda çapraz direnç ve duyarlılığa sahip mutant olduğu bulundu: R12 suşu referans suşa (905) kıyasla, CuCl2, NH4Fe(SO4)2, NaCl, koniferil aldehit, vanilin, sikloheksimit, propolis'e karşı çapraz dirençli; ve AlCl3, CoCl2, H3BO4 ve AgNO3'e duyarlı bulundu. Rapamisine dirençli mutantın (R12) hücre duvarı bütünlüğünü test etmek için litikaz duyarlılık testi yapıldı. Bu deneyin sonucu, R12'nin stressiz koşullar altında litikaza 905'ten daha fazla direnç gösterdiğini gösterdi. Öte yandan, rapamisin stresi altında, 905 litikaza R12'den daha fazla direnç gösterdi. Ayrıca, rapamisin stresinin varlığı, stressiz duruma kıyasla evrimleşmiş R12 suşunun litikaz direncini değiştirmedi. Rapamisine dirençli suşun (R12) kronolojik ömrü, yarı kantitatif ve ayrıca kantitatif kronolojik ömür analizi kullanılarak belirlendi. Deneylerin sonuçları birbiriyle tutarlı olup, ayrıca R12'nin 905'e kıyasla daha kısa bir CLS'ye sahip olduğu görüldü. Rapamisine dirençli mutantın (R12) karşılaştırmalı tüm genom dizileme analizi, dört tek nükleotit varyasyonunu (SNV'ler) ortaya çıkardı. Bu SNV'ler dört farklı gende tespit edildi. Bu genlerin mayadaki rapamisin yanıtı ve direncindeki kesin işlevlerini ortaya çıkarabilmek için, daha ayrıntılı çalışmaların yapılması gerekmektedir. Sonuç olarak, bu tez çalışmasında evrimsel mühendislik yöntemi kullanılarak rapamisin stresine karşı dirençli ve genetik olarak kararlı bir S. cerevisiae suşu (R12) başarıyla elde edilmiş olup, bu suşun genomik ve fizyolojik düzeyde karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu sonuçlar, yüksek rapamisin stres seviyelerinin üstesinden gelebilmek için, rapamisine dirençli mutantta, TOR yolağı ile ilgili değişikliklerin meydana geldiğini göstermektedir. Bununla birlikte, R12'nin rapamisin direncinin moleküler temelini tam olarak anlayabilmek için, ileride karşılaştırmalı transkriptomik ve metabolik analizlerin de gerçekleştirilmesi uygun olacaktır.
Özet (Çeviri)
The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a unicellular eukaryotic microorganism, is widely used in many industrial processes such as baking, alcohol fermentation, biofuel and recombinant protein production as well as in basic research to understand the complex biological processes of advanced eukaryotic organisms, including humans due to its well-characterized genome and proteome, ease of growth and manipulation, as well as the similarity of its genes and pathways to higher organisms. Rapamycin is a macrolide compound that is produced by the bacterium Streptomyces hygroscopicus. In the medical field, rapamycin and its analogs are used to prevent organ transplant rejection, coat coronary stents and treat tumor cells. Many key metabolic pathways including cell growth and lifespan, protein synthesis and ribosome biogenesis, regulation of cell cycle and size, environmental stress response, nutrient uptake, starvation control, and autophagy in S. cerevisiae and also other higher eukaryotes are affected by rapamycin due to its inhibition of the target of rapamycin (TOR). Fkbp12 forms a complex with rapamycin that interacts with TOR resulting in its inhibition where the exact mechanism is still unknown. Fkbp12, immunophilin, is conserved in its structure and function among eukaryotes from yeasts to mammalians. Fpr1 found in S. cerevisiae is an orthologue of Fkbp12 found in humans. In this study, an inverse metabolic engineering strategy, evolutionary engineering was used to obtain rapamycin stress-resistant S. cerevisiae. Thus, serial batch cultivation of the S. cerevisiae CEN.PK113-7D reference strain under gradually increasing rapamycin stress was carried out. Before selection, a screening experiment was performed and 3 ng/ml rapamycin stress was determined as the initial stress level. During the selection process, the concentration of rapamycin in the medium was gradually increased from 3 ng/ml to 200 ng/ml over 61 daily passages or populations. From the final population, fifteen individual colonies were randomly selected which were named R1 to R15. Every individual (R1 to R15) was highly resistant to rapamycin stress in comparison to the reference strain (905). Afterward, R1, R3, R7, R12 and R14 were selected to continue for genetic stability test in which they were found to be genetically stable and their resistance to rapamycin was shown to be permanent. Genetically stable strains were tested by spot assay for their cross-resistance or sensitivity against various stress types, including 0.5 mM NiCl2, 2.5 mM CrCl3, 3 mM CoCl2, 17.5 mM MnCl2, 50 mM NH4Fe(SO4)2, 10 mM AlCl3, 20 mM CuCl2, 15 mM LiCl, 50 mM H3BO4, 100 µM AgNO3, 0.5 M NaCl, 15 mM caffeine, 4 mM vanillin, 200 ng/ml propolis, 1mM coniferyl aldehyde and 200 ng/ml cycloheximide. R12 was found to be the mutant with the highest number of cross-resistance and sensitivities: R12 strain was cross-resistant to CuCl2, NH4Fe(SO4)2, NaCl, coniferyl aldehyde, vanillin, cycloheximide, propolis; and sensitive to AlCl3, CoCl2, H3BO4 and AgNO3 in comparison to the reference strain (905). In order to determine the cell wall integrity of the rapamycin-resistant mutant (R12), lyticase susceptibility assay was performed. The result of this experiment showed that R12 resisted lyticase more than 905, under nonstress condition. On the other hand, under rapamycin stress, 905 resisted lyticase more than R12. Furthermore, the presence of rapamycin stress did not change the lyticase resistance of the evolved strain R12, in comparison to the nonstress condition. The chronological lifespan of rapamycin resistant strain (R12) was determined by using semi-quantitative and also quantitative chronological lifespan analysis. The result of the experiments correlated with each other in which R12 was found to have a shorter CLS, in comparison to 905. Comparative whole genome sequencing analysis of the rapamycin-resistant mutant (R12) revealed four single nucleotide variations (SNVs). These SNVs were located in four different genes. The precise functions of these genes in rapamycin response and resistance in yeast should be examined in greater detail in future studies. In conclusion, a rapamycin-stress-resistant and genetically stable S. cerevisiae strain (R12) was successfully obtained by using evolutionary engineering in this thesis study, and characterized at genomic and physiological levels. These results indicate that TOR pathway-related changes occurred in rapamycin-resistant mutant in order to overcome the high levels of rapamycin stress. However, in order to fully comprehend the molecular basis of rapamycin-resistance of R12, its comparative transcriptomic and metabolic analyses would be necessary as future studies.
Benzer Tezler
- Inverse metabolic engineering and molecular characterization of caffeine-resistant saccharomcyes cerevisiae
Kafeine dirençli saccharomcyes cerevisiae'nin tersine metabolik mühendislik ile eldesi ve moleküler karakterizasyonu
YUSUF SÜRMELİ
Doktora
İngilizce
2020
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Evolutionary engineering of phenylethanol-resistant saccharomyces cerevisiae
Evrimsel mühendislik yöntemi ile feniletanole dirençli saccharomyces cerevisiae suşlarının eldesi
CAN HOLYAVKİN
Yüksek Lisans
İngilizce
2013
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Evolutionary engineering of polyphenol resistance in lactic acid bacteria
Laktik asit bakterilerinin polifenol direncinin evrimsel mühendislik ile geliştirilmesi
TARIK ÖZTÜRK
Doktora
İngilizce
2018
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Evolutionary engineering of Rhodobacter sphaeroides under selective CoCl 2 stress
Evrimsel mühendislik yöntemi ile Rhodobacter sphaeroides'in CoCl 2 stresine dirençli suşlarının eldesi
HANAY KAMER
Yüksek Lisans
İngilizce
2015
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Evolutionary engineering of freeze tolerance in Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae'da donma toleransının evrimsel mühendisliği
FEYZA ŞERİFE KÜÇÜK