Strategies for isolation of novel enzymes by using metagenomics approach

Metagenomik yaklaşım kullanılarak yeni enzimlerin elde edilmesi

PDF İndir

Tez No: 465429
Yazar: HAVVA ESRA TÜTÜNCÜ
Danışmanlar: PROF. DR. NEVİN GÜL-KARAGÜLER
Tez Türü: Doktora
Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
Yıl: 2017
Dil: İngilizce
Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
Sayfa Sayısı: 152

Özet

Mikroorganizmalar birçok biyoteknolojik uygulama için kullanılmakta ve hem bilimsel hem de endüstriyel önemleri sebebiyle birçok araştırmacının ilgi alanına girmektedirler. Geleneksel mikrobiyolojik yöntemlerde mikroorganizmalar yaşadıkları yerlerden izole edilmekte ve kültüre edilerek büyütülmektedirler. 2000'li yıllara kadar mikroorganizmaların kültüre edilmeden karakterize edilemeyeceğine inanılmaktaydı. Fakat yapılan bilimsel gözlemler ile var olan mikroorganizmaların sadece çok küçük bir bölümünün kültüre edilebildiği ortaya çıkarılmıştır. Bu yüzyılın başında, literatüre metagenomiks adıyla yeni bir çalışma alanı girmiştir. Metagenomiks herhangi bir ortamda yaşayan mikroorganizmaların kültüre bağımlı olmadan çalışılması olarak tanımlanmaktadır. Metagenomik çalışmalar fonksiyon veya dizi bazlı yaklaşımlarla gerçekleştirilebilmektedir. Fonksiyon bazlı yaklaşımda, genom kütüphanesine benzer olarak bir metagenomik kütüphane kurulmakta ve bu kütüphane istenilen fenotip bakımından taranmaktadır. Dizi bazlı metagenomikste, ya tüm metagenomun dizi analizi yapılmakta, ya da önceden bilinen dizi bilgisi kullanılarak metagenomda yer alan spesifik bölgeler çoğaltılarak analiz edilmektedir. Ekstremofiller ekstrem koşullarda kararlılıklarını koruyabilen makromolekülleri sebebiyle endüstriyel biyoteknolojide büyük potansiyele sahip mikroorganizma gruplarıdır. Bu makromoleküller içinde yer alan ekstremozimler birçok enzim katalizli reaksiyonlarda ihtiyaç duyulan sert koşullarda aktivitesini ve stabilitesini koruyabilmektedirler. Fakat ekstrem özellikleri sebebiyle ekstremofilik mikroorganizmaları doğal yaşam alanlarından alıp laboratuvar koşullarında büyütmek her zaman mümkün olmamaktadır. İşte bu noktada metagenomiks karşımıza çıkmaktadır. Bu çalışmada metagenomiks yaklaşım ile ekstrem ortamlardan lipolitik enzim eldesi amaçlanmıştır. Bu amaçla hem fonksiyon bazlı hem de dizi bazlı çalışmalar yapılmıştır. Çevresel örnekler asidofilik mikroorganizmaları barındıran Balıkesir, Balya asit maden sahası ve halofilik mikroorganizmaları barındıran Acıgöl, Denizli'den alınmıştır. Önceki çalışmalarda, asit maden sahasından alınan örneklerle metagenomik fosmid kütüphanesi kurulmuş ve iki adet potansiyel koloni (F1 ve F3) elde edilmişti. Bu tez kapsamında, bu potansiyel lipolitik enzimleri tanımlamak amacıyla uygulanabilecek stratejiler sunulmuştur. İlk olarak, F3 fosmidinin alt klonlama kütüphanesi kurulmuştur. F3 fosmidi HindIII ve EcoRI enzimleri ile kesilmiş, pUC19 plazmitine yapıştırılmış ve E. coli DH5α hücrelerine transforme edilmiştir. Elde edilen koloniler lipolitik aktivite bakımından taranmıştır. Bir adet aktif koloni tespit edilmesine rağmen dizi analizi ile olumlu bir sonuç alınamamıştır. İkinci bir strateji olarak başlangıç seviyesinde fonksiyonel analiz yapılmıştır. F1 ve F3 kolonileri 1 litre kültür hacminde büyütülüp hücre lizatları elde edilmiştir. Tribütirin ve agar içeren katı yüzey üzerinde delikler açılarak buralara lizat eklenmiş ve enzim aktivitesine bağlı olarak zon oluşumu gözlenmiştir. Lizatta aktivite varlığı doğrulandıktan sonra proteinler amonyum sülfat çöktürmesi ile fraksiyonlara ayrılmıştır. Substrat olarak para-nitrofenol palmitat kullanılarak her bir fraksiyonun enzimatik aktivitesi ölçülmüştür. F3 örneğinde aktivite gözlenmezken F1 örneğinin %45-%70 doygunlukta amonyum sülfat çöktürmesi sonucu elde edilen fraksiyonunda kontrole göre 1.45 kat fazla aktivite görülmüştür. Bu fraksiyondaki proteinler ultrafiltrasyon tüpleri ile moleküler ağırlıklarına göre ayrılmış, 30-50 ve 50-100 kDa arasındakiler ise iki boyutlu jel elektroforezi ile analiz edilmiştir. F1 ve kontrol örneklerine ait jeller karşılaştırılmış ve farklı olan spotlar kesilerek kütle spektrometresi ile analiz edilmiştir. Yapılan ön denemelerle aktivite tespit edilmesine rağmen, hedeflenen proteinler proteomik yaklaşım ile tespit edilememiştir. Üçüncü bir alternatif olarak, F3 fosmidinin dizi analizi yapılmıştır. Kısmi Sanger dizileme ile klonlanan genin Acidithiobacillus türlerine ait olduğu belirlenmiş ve kütüphanenin asidofilik organizmaları temsil ettiği doğrulanmıştır. Tüm fosmid dizisinin belirlenmesi amacıyla ileri nesil dizi analizi yaptırılmıştır. Elde edilen dizide asidofilik organizmalara ait genler bulunmuş ve içlerinden bir tanesi alfa/beta hidrolaz katlanmasına sahip enzimlerle benzerlik göstermiştir. Daha detaylı analizlerin ileriki çalışmalarla gerçekleştirilmesi planlanmaktadır. Çalışmanın ikinci bölümünde, tuzlu bir göl olan Acıgöl'den alınan çevresel örnekler ile dizi bazlı metagenomiks çalışması yapılmıştır. Sahanın mikrobiyal çeşitliliği daha önceki çalışmalarda belirlenmiştir. Bu çalışma kapsamında bu mikroorganizmalara ait lipolitik enzimlerin nükleotit dizileri veritabanlarından alınmış ve benzerliklerine göre gruplanmıştır. Her bir gruptaki nükleotit dizileri kullanılarak lipolitik enzimlerin korunmuş bölgelerini hedefleyen dejenere primerler oluşturulmuştur. Primer tasarımında CODEHOP stratejisi kullanılarak primer4clades programından faydalanılmıştır. Lipazlar ve lipolitik enzimler, α/β hidrolaz katlanmasına sahip enzimler ve karboksilesterazlar olmak üzere üç grup için toplamda dokuz çift primer tasarlanmıştır. Tüm primer setleri ile PZR çalışmaları yapılmış, α/β hidrolaz katlanmasına sahip proteinler için tasarlanan primerler ile pozitif sonuç alınmıştır. Çoğaltılan gen, pCRTM-4TOPO® vektörüne klonlanmış ve E. coli TOP10 hücrelerine transforme edilmiştir. Dizi analizi sonucunda klonlanan genin beklenildiği gibi 480 baz çifti uzunluğunda olduğu belirlenmiştir. BLAST analizinde dizinin Halolamina sediminis genomuyla %75 benzerlik gösterdiği bulunmuştur. Genin bilinmeyen 5' ve 3' uçlarını belirlemek için“genome walking”uygulanmıştır. Dejenere PZR ile elde edilen dizi bilgisinden yola çıkılarak her bir uç için 2'şer adet gene özgü primer tasarlanmıştır. Metagenomik DNA restriksiyon enzimleri ile kesilmiş ve uçlarına adaptör diziler yapıştırılmıştır. İlgili gene ve adaptöre özgü primerler ile bilinmeyen 5' ve 3' uçlar çoğaltılmış, dizi analizi yapılmış ve tam gen dizisi bulunmuştur. Gen 783 baz çifti uzunluğunda, 260 aminoasitten oluşmaktadır. ATG başlangıç kodonu ile başlayan gen UGA bitiş kodonu ile sonlanmaktadır. Gen dizisi Halolamina sediminis genomunun bir parçasına %75 oranında benzemektedir. Aminoasit dizisi ise Halomonas gudaonensis organizmasının esterazına %91 oranında benzemektedir. Bu sonuçla çevresel bir örnekten yeni bir enzimin başarıyla klonlandığı sonucu ortaya çıkmaktadır. Proteinin moleküler ağırlığı ve izoelektrik noktası ExPASy programı ile hesaplanmış ve sırasıyla 28368 Da ve 5,27 olarak bulunmuştur. Ekspresyon çalışması için genin 5' ve 3' uçlarını hedefleyen ve içlerinde EcoRI ve HindIII kesim bölgelerini içeren primerler tasarlanmıştır. Metagenomik DNA'nın kalıp olarak kullanıldığı PZR ile çoğaltılan gen, pET-28a(+) ekspresyon vektörüne klonlanmştır. Oluşturulan plazmit E. coli C43 (DE3) ekspresyon hücresine aktarılmıştır. Ekspresyonu optimize etmek için 0,1, 0,5 ve 1 mM IPTG konsantrasyonları denenmiştir. Ayrıca indükleme işlemi 25ºC'de 16 saat, 30ºC'de 6 saat ve 37ºC'de 3 saat boyunca yapılmış ve en iyi sonucun 0,1 mM IPTG konsanstrasyonunda, 30ºC'de 6 saatte elde edildiği gözlenmiştir. Gen başarıyla ifade edildikten sonra His-tag yöntemi ile saflaştırma çalışmaları başlatılmıştır. SDS-PAGE analizi ile saflaştırmanın başarılı bir şekilde gerçekleştiği belirlenmiş ve enzimin molekül ağırlığının (28,2 kDa) teorik değeri (28,4 kDa) ile uyumlu olduğu gözlenmiştir. Proteinin halofilik bir organizmadan geliyor olmasına bağlı olarak %10 NaCl varlığında daha kararlı olduğu belirlenmiştir. Enzimin aktivitesi substrat olarak para-nitrofenol esterleri kullanılarak ölçülmüştür. Kinetik deney, enzimin ester bağını hidroliz etmesi sonucu açığa çıkan para-nitrofenolün (pNP) 410 nm'de absorbansının ölçülmesine dayanmaktadır. Spektrofotometik ölçüm için reaksiyon koşullarında ışık yolu ve pNP'nin ekstinksiyon katsayısı aktivite ölçümlerinden önce hesaplanmştır. Enzimin substrat özgüllüğünü belirlemek için pNP-butirat, pNP-hekzanoat, pNP-oktanoat, pNP-dekanoat, pNP-dodekanoat ve pNP-hekzadekanoat substratları kullanılmıştır. Enzim maksimum aktiviteyi pNP-hekzanoat substratına karşı göstermiştir (kcat = 12.30 s-1). Enzimin pNP-butirat (6.03 s-1) ve pNP-oktanoata (6.26 s-1) karşı da yüksek aktivitesinin olduğu gözlenmiştir. Enzimin kısa karbon zincirli substratları tercih etmesi sebebiyle esteraz enzimi olduğu belirlenmiştir. Enzimin çalıştığı optimum pH değerinin 9 olduğu ve pH 8 ile 10 arasında 24 saat inkübe edildiğinde aktivitesini koruduğu gözlenmiştir. Enzimin pH 6 ve daha düşük pH değerlerinde çözeltilerde inkübe edildiğinde aktivitesini kaybettiği belirlenmiştir. Enzimin optimum sıcaklığının 30ºC olduğu, fakat 5ºC ve 40ºC sıcaklıkları arasında da maksimum aktivitesinin %50'sinden fazlasını gösterdiği belirlenmiştir. Enzim 55ºC'de 20 dakika inkübasyon sonunda aktivitesinin %96'sını korurken, 60ºC'de inkübe edildikten sonra aktivitesi %27'ye düşmüştür. NaCl konsantrasyonu arttıkça, enzimin aktivitesi düşmüş fakat NaCl (%10-%25) ile inkübasyonun enzimin stabilitesi üzerinde bir etkisi olmamıştır. Enzimin aktivitesi %10 organik çözücü varlığında da ölçülmüştür. DMSO varlığı enzimin aktivitesini etkilemezken, gliserol aktivitede hafif bir yükselişe sebep olmuştur. Metanol varlığında ise aktivite maksimum değerinin %80'i olarak ölçülmüştür. Diğer organik çözücüler enzim üzerinde inhibe edici etki göstermiştir. Enzimin %15 ve %30 konsanstrasyonlarında farklı organik çözücüler ile 24 saat boyunca inkübe edildikten sonra kalan aktivitesi ölçülmüştür. Enzim %30 1-propanol ve %30 isopropanol haricinde tüm organik çözücülere karşı stabilitesini korumuştur (>%80). Farklı metal iyonları, deterjanlar ve enzim inhibitörlerinin etkileri de araştırılmıştır. Literatürde rapor edilmiş benzer enzimler ile karşılaştırıldığında enzimin yüksek metal toleransı olduğu bulunmuştur. PMSF'in enzimi inhibe ettiği gözlenmiş ve bu durum enzimin bir serin hidrolaz olduğunu doğrulamıştır. Enzim saklama koşullarında (50 mM Tris-HCl pH 8 + %10 NaCl, 4ºC) aktivitesini 14. güne kadar korumuştur.

Özet (Çeviri)

Microorganisms have been used for many biotechnological applications. Due to their both scientific and industrial importance, they have attracted many researchers. In traditional microbiological methods, microorganisms are isolated from their environment and grown in cultures. Until 2000s, it was believed that the microorganisms could not be characterized without culturing. However, scientific observations revealed the fact that only tiny amount of microorganisms could be grown in pure cultures. At the beginning of this century, a new field called metagenomics was entered to the literature. It is defined as the culture independent study of microorganisms that live in any environment. Metagenomic studies can be accomplished by function or sequence based approaches. In function based approach, a metagenomic library, as similar to genome library, is constructed and screened for desired phenotype. In sequence based metagenomics, either the metagenome is sequenced or already known sequence information is used to amplify specific regions from the metagenome. Extremophiles, as the most interesting group of microorganisms have great potential in industrial biotechnology, due to their macromolecules that conserve their stability in extreme conditions. Among these macromolecules, extremozymes are usually stable and active in harsh conditions, which is desired for many industrial enzyme catalyzed reactions. However, due to their extreme characteristics, it is not always possible to isolate an extremophile from its natural habitat and grow in laboratory conditions. At this point, metagenomics become an efficient approach to isolate novel enzymes from extremophiles. In this study, it is aimed to isolate lipolytic enzymes from extreme environments by metagenomics approach. Both function based and sequence based approaches were applied. Environmental samples were collected from acid mine drainage site (Balıkesir, Turkey; acidic environment) and a hypersaline lake (Acıgöl, Turkey; high-saline environment). In previous studies, a metagenomic fosmid library was constructed from acid mine drainage site and two potential clones (named F1 and F3) were detected. Within the scope of this thesis, strategies that can be applied in function based metagenomics approach are presented to identify the potential lipolytic enzymes. Firstly, subcloning library of F3 fosmid was constructed. F3 fosmid was partially digested with HindIII and EcoRI and ligated to pUC19 plasmid. Resulting constructs were transformed to E. coli DH5α cells and each clone was screened for lipolytic activity. One of the transformants gave positive result but the gene could not be identified by sequence analysis. As a second strategy, preliminary functional analysis was perfomed. Crude lysates of F1 and F3 clones were prepared and tested for lipolytic activity on agar plates. Once the positive results were obtained, crude lysates of F1 and F3 were partially purified by ammnonium sulfate precipitation. Each fraction was tested for lipolytic activity using para-nitrophenol palmitate as substrate. No activity was detected for F3 but 45%-70% fraction of F1 has 1.45 fold more activity compared to control. To further analyze the proteins in cleared lysates of F1, they were fractioned according to their molecular weight. Fractions between 30-50 and 50-100 kDa were analyzed by two dimensional gel electrophoresis. Gel results for F1 and FC were compared and spots that differ between gels were cut for analysis with mass spectrometry. Although the activity was verified with the preliminary functional studies, the targeted protein could not be identified with proteomic approach. As a third alternative, fosmid sample from F3 clone was sequenced. The partial Sanger sequencing revealed that the cloned insert match with nucleotide sequences from Acidithiobacillus species, verifying the acidophilic origin of the genome library. To identify the whole fosmid sequence, sample was sent for next generation sequencing. Partial sequences belonging to acidophilic microorganisms were obtained. A potential sequence similar to alpha/beta hydrolase fold enzymes was detected. Detailed analysis is going to be conducted with further studies. In the second part of the study, sequence based metagenomics approach was applied by using environmental samples collected from hypersaline lake Acıgöl. In previous studies, the microbial diversity of the samples were identified. Within the scope of this study, nucletide sequences of the lipolytic enzymes of these microorganisms were retrieved from databases. They were grouped according to their similarities. Each group was used for degenerate primer design, targeting conserved regions among lipolytic enzymes. Primers were designed by primer4clades online tool, using CODEHOP strategies. A total of nine degenerate primer pairs could be designed for 3 groups, including lipases and lipolytic enzymes, α/β hydrolase fold enzymes and carboxylesterases. While PCR was set for all primer pairs, only one positive result was obtained with the set of primers targeting α/β hydrolase fold enzymes. The obtained amplicon was cloned to pCRTM-4TOPO® vector and transformed to E. coli TOP10 cells. Sequence analysis revealed an insert of 480 bp as expected. When compared with BLAST, the sequence matched with Halolamina sediminis strain with an identity of 75%. To identify the unknown 5' and 3' ends, genome walking strategy was applied. For each end, two sets of gene specific primers were designed according to the partial sequence obtained by degenerate PCR. Metagenomic DNA was digested with restriction enzymes and adaptors were ligated to ends of digested DNA fragments. Using gene specific and adaptor specific primers, unknown 5' and 3' ends were amplified. After sequence analysis, fragments were assembled to yield a full length gene. The gene was composed of 783 bp, which corresponds to 260 amino acids. The gene starts with ATG start codon and ends with UGA stop codon. The gene sequence best matched with Halolamina sediminis with an identity of 75%. Deduced amino acid sequence best matched with the esterase from Halomonas gudaonensis with an identity of 91%. This result showed that a novel enzyme was successfully isolated from an environmental sample. The molecular weight and pI of the protein was calculated as 28368 Da and 5.27, respectively, using the ExPASy tool. To express the novel enzyme, primers targeting 5' and 3' of the novel gene with EcoRI and HindIII restriction sites were designed. The gene was amplified using metagenomic DNA as template and cloned into pET-28a(+) expression vector. The construct was transformed to E. coli C43 (DE3) chemically competent cells. To optimize the expression, 0.1, 0.5 and 1 mM IPTG concentrations were tried. In addition, induction at 25ºC for 16 hours, 30ºC for 6 hours and 37ºC for 3 hours were tried. The optimum expression was observed with 0.1 mM IPTG at 30ºC for 6 hours. After the gene was successfully expressed, purification studies were conducted. The protein was purified using His-tag method. Analysis with SDS-PAGE showed that the purification was successful. The apparent molecular weight of the protein (28.2 kDa) was consistent with the theoritical molecular weight, which was calculated as 28.4 kDa. The protein was found to be more stable in the presence of 10% NaCl, consistent with the halophilic nature of the protein. The activity of the protein was determined with kinetic assay, using para-nitrophenyl esters as substrate. The enzyme hydrolyzes the ester bond and the increasing absorbance of released pNP is measured at 410 nm. The path length for spectrophotometric measurements and the extinction coefficient of pNP at each reaction condition was calculated before activity calculations. To determine the substrate specificity, activity towards pNP-butyrate, pNP-hexanoate, pNP-octanoate, pNP-decanoate, pNP-dodecanoate and pNP-hexadecanoate were calculated. The enzyme showed a maximum activity towards pNP-hexanoate with a kcat value of 12.30 s-1. Also, the activity towards pNP-butyrate (6.03 s-1) and pNP-octanoate (6.26 s-1) was high. Its preference for short carbon chain length substrates indicates that it is an esterase. The optimum pH of the enzyme was found to be 9 and the enzyme was stable after storage at pH 8 to 10 for 24 hours. The enzyme completely losts its activity after storage at pH values below 6. The optimum temperature of the enzyme was found to be 30ºC but it is retains more than 50% of its maximum activity between 5ºC and 40ºC. The enzyme retains 96% of its maximum activity after incubation at 55ºC but the activity was dropped to 27% of its maximum after incubation at 60ºC. As the NaCl concentration increases, the activity of the enzyme drops but storage with increasing NaCl concentrations (10% to 25%) did not affect the stability of the enzyme. The effect of organic solvents (10%) on the activity of the enzyme was also investigated. While the presence DMSO did not affect the activity of the enzyme, glycerol slightly increased the activity. Activity in the presence of methanol was 80% of its maximum and other solvents showed inhibitory effect on the enzyme. The enzyme was found to be organic solvent tolerant that when stored with different organic solvents at 15% and 30% concentrations for 24 hours, except for 30% isopropanol and 30% 1-propanol, it retains more than 80% of its maximum activity. The effect of various metal ions, detergents and inhibitors were also investigated. The esterase was found to highly tolerant to metal ions as compared with the similar enzymes in the literature. The enzyme was inhibited by PMSF, confirming that it is a serine hydrolase. The enzyme is stable in storage conditions, that it retains its activity in storage buffer until 14th day at 4ºC.

Benzer Tezler

Tez No
688848
Recombinant production and characterization of serine protease enzyme from Virgibacillus sp. AGTR strain using site directed mutagenesis
Virgibacillus sp. AGTR suşundan izole edilen serin proteaz enziminin bölgeye yönelik mutagenez yöntemi kullanılarak rekombinant üretimi ve karakterizasyonu
EVRİM KAPUCU
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
Biyokimya İstanbul Teknik Üniversitesi
Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
Tez No
629325
Recombinant production of a glycosidase by using an in-vivo cloning system and its immobilization via different strategies
Hücre içi klonlama sistemi kullanarak rekombinant glikosidaz üretimi ve immobilizasyonu
BURCU PEKDEMİR
Yüksek Lisans
İngilizce
2020
Biyokimya Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi
Biyomoleküler Bilimler Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. SERCAN KARAV
Tez No
518305
Alanine scanning on the active site of a novel esterase
Yeni bir esteraz enziminin aktif bölgesinde alanin taraması
SEDA KARAKAŞ
Yüksek Lisans
İngilizce
2018
Biyoteknoloji İstanbul Teknik Üniversitesi
Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL-KARAGÜLER
Tez No
713843
Biodegradation of chlorinated compounds at interfaces and biodegradation of 4-nitroaniline
Arayüzlerde klorlu bileşiklerin biyolojik bozunması ve 4-nitroanilinin biyolojik bozunması
ZÖHRE KURT
Doktora
İngilizce
2012
Çevre Mühendisliği Georgia Institute of Technology
Çevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. JİM SPAİN
Tez No
506666
Isolation of novel Quorum quenching bacteria for the control of membrane biofouling and the effect of Bacillus sp. T5 and Delftia sp. T6 on microbial community structure in membrane bioreactor
Membran biyotıkanmasının kontrolü amacıyla yeni Quorum quenching bakterilerinin izolasyonu ve Bacillus sp.T5/Delftia sp. T6 türlerinin membran biyoreaktördeki mikrobiyal komüniteye etkisinin belirlenmesi
BAHAR YAVUZTÜRK GÜL
Doktora
İngilizce
2018
Biyomühendislik İstanbul Teknik Üniversitesi
Çevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. İSMAİL KOYUNCU

Geri Dön