Role of DNA topoisomerase IIβ in osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells
İnsan mezenkimal kök hücrelerinin osteogenik farklılaşmasında DNA topoizomeraz IIβ'nın rolü
- Tez No: 472532
- Danışmanlar: DOÇ. DR. BEDİA PALABIYIK
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Genetik, Moleküler Tıp, Tıbbi Biyoloji, Genetics, Molecular Medicine, Medical Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2017
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 139
Özet
Memeli hücrelerinde transkripsiyonel düzenleme bir dizi enzim ve protein aktivitesi ile sağlanmaktadır. DNA topoizomeraz II (topo II) enzimleri hücrede replikasyon, kromatin organizasyonu, transkripsiyon gibi hücrenin kaderini belirleyen birçok hayatsal faaliyette aktif rol oynamaktadır. Memeli hücrelerinde α ve β izoformu bulunan topo II enzimleri, yapısal olarak benzer ancak hücre çoğalması ve farklılaşma sürecinde işlev olarak değişkenlik göstermektedir. Topo IIα, mitoz geçiren hücrelerde homolog kromozomların ayrılmasında görevli ana enzim iken, topo IIβ çoğalan ve çoğalmayan (farklılaşmış) bütün hücrelerde ifade edilmektedir. Bu durum, topo IIβ'nın kromozomların birbirlerinden ayrılması haricinde, transkripsiyon, DNA tamiri gibi özelleşmiş başka hücresel olaylarda görev yapabileceğini akla getirmektedir. Son yıllardaki araştırmalar topo IIβ'nın DNA üzerinde bazı genlerin transkripsiyon esnasında açılması ve ifadesinin düzenlenmesini sağladığını göstermektedir. Özellikle nöral farklılaşma esnasında akson uzamasındaki rolü ile ilgili yoğun çalışmalar bulunmaktadır. Ayrıca DNA tamir mekanizmasında da gerekli bir enzim olduğu bildirilmiştir. İnsan mezenkimal kök hücreleri (iMKH) farklılaşma potansiyelleriyle araştırma ve klinik uygulama açısından rol model olarak kullanıma açık hücrelerdir. Ancak primer iMKH'lerin elde edilmesindeki zorluklar, hücre alımının gercekleştiği bireyin yaşına bağlı olarak laboratuvar kosullarına alınan hücrelerin farklılaşma potansiyelini etkileyen faktörler ve sınırlı bölünebilme özellikleri nedeniyle in vitro çalışmalarda primer hücrelerden ziyade iMKH hattı kullanımı avantaj sağlamaktadır. Farklılaşma süreci hücrede transkripsiyonel düzenleme ve değişim aşamalarını ifade etmektedir. Yapılan in vivo ve in vitro çalışmalar ile topo IIβ'nın bu noktada etkili bir faktör olduğu belirlenmiştir. Literatürde iMKH'lerin nöral farklılaşma sürecindeki etkisine yoğunlaşılmış ancak diğer farklılaşma türlerindeki olası ve genel fonksiyonu çalışılmamıştır. Bu nedenle, topo IIβ enziminin nöral farklılaşmaya özgün bir fonksiyonu mu olduğu, yoksa diğer hücre farklıklaşmalarında da genel bir kontrol faktörü mü olduğu bilinmemektedir. Çalışmanın cıkış noktasını oluşturan bu fikir ile topo IIβ enziminin iMKH'lerin osteogenik farklılaşma yolağındaki genlerin transkripsiyonu üzerine etkisi araştırılmıştır. Bu amaçla, yüksek verimlilikte osteogenik farklılaşma potansiyeline sahip iMKH hattında, topo IIβ'nın osteoblastik genlerin aktivasyonunda rolü olup olmadığı araştırılmıştır. Çalışmada, iMKH hattında, ticari olarak elde edilen osteogenik farklılaşma faktörleri kullanılarak indüklenmiş osteogenik farklılaşma gerçekleştirilmistir. Farklılaşma sürecinin teyidi, özel osteogenik belirteçlerin, histolojik boyamalar (Toluidine mavisi, Alizarin kırmızısı) ve moleküler düzeyde gen ifade profilinin (BSP, OPN, OCN). RT-qPCR (Gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu) yöntemiyle belirlenmesiyle gerçekleştirilmiştir. Osteoblastik hücre populasyonu eldesinin teyidi sonrası, topo IIβ geninin belirlenen zaman dilimlerinde siRNA (small interfering RNA) tekniği ile susturulması ve nukleofeksiyon teknigi ile aşırı ifadesi calışmaları yapılmıştır. Belirlenen zamanlarda osteogenik farklılaşma ile birlikte topo IIβ gen ifadesinin engellenmesi ve aşırı ifadesi ile başlatılan deneysel süreç, son aşamada topo IIβ susturulan gruplarda daha güvenilir sonuçların gözlemlenmesinden dolayı yalnızca bu gruplar ile devam etmiştir. Son aşamada belirlenen günlerde ve topo IIβ susturularak elde edilmiş deneysel koşullarda osteogenez ve osteoporoz (OP) ile alakalı genlerin kıyaslanması PCR array tekniği ile yapılmıştır. Deneylerde kulllanılan gruplar: herhangi bir uygulama veya osteogenik indükleme yapılmamış iMKH kontrol grubu (NT-UD), osteogenik farklılaşmaya indüklenmiş iMKH grubu (Ost.), osteogenik farklılaşmaya indüklenmiş ve özgün siRNA'lar ile topo IIβ susturulmuş iMKH grubu (Ost.+siTopo IIβ) ve osteogenik farklılaşmaya indüklenmiş ve topo IIβ aşırı ifadesi yapılmış iMKH'lerden (Ost+OE) oluşmaktadır. siRNA indüklü topo IIβ gen susturulması belirlenen tüm zaman aralıklarında, çeşitli yöntemlerle analiz edilen ilgili belirteçlerin ifadesinde ve osteogenik farklılaşmanın ilerleyişinde azalmalara sebep olmuştur. Topo IIβ aşırı ifadesi ise kullanılan transfeksiyon yönteminin iMKH'lerin yoğun strese maruz kalmaları ve ölümüne sebep olması nedeniyle hücrelerin toparlanma süreçlerini uzatmış ve osteogenik farklılaşmanın ilerleyişi planlanan şekilde gözlemlenememiştir. Osteogenez ve OP ile ilgili gen taramalarını içeren PCR array sonuçları da topo IIβ gen susturulması gerçekleşmiş örneklerde osteoblastik farklılaşma ile ilgili genlerin negatif yönde etkilendiğini göstermiştir. Yalnızca osteogenik farklılaşmaya yönlendirilen iMKH'lerde ise bu genlerin oldukça fazla ifade edildiği gösterilmiştir. Sonuç olarak, topo IIβ aktivitesinin iMKH'nın osteogenik farklılaşmada gerekli olduğu ve osteblastik hücre populasyonunun elde edilmesinde önemli olduğu gösterilmiştir. Osteoblast populasyonunun devamlılığı hücre farklılaşması aracılığıyla sağlandığından iMKH'lerin ostegenik farklılaşmasında etkili olan biyolojik moleküllerin ve ayırıcı gen ifade profillerinininin belirlenmesi, hem osteopatolojik hastalıkların teşhis ve tedavisi açısından yol gösterici olacak hem de hücre tipine özel farkılaşma sürecinin moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasına katkıda bulunacaktır. Bu yönüyle tez benzer calışmalar ve tedavi temelli yaklaşımlar için yardımcı kaynak olacaktır.
Özet (Çeviri)
In mammalian cells transcriptional regulation is provided with the activity of a serial enzyme and protein members. DNA topoisomerase II (topo II) enzymes play active roles in many crucial functions including replication, chromatin organization and transcription that determine the fate of the cell. In mammalian cells topo II enzymes that have two isoforms as α and β, have similar structures but they show variable functions in proliferation and differentiation processes. While topo IIα is main enzyme, functional in chromosome segregation of mitotic cells, topo IIβ is expressed in all proliferative and non-proliferative (differentiated) cells. This suggests that topo IIβ might have functions on some other specialized cellular processes such as transcription and DNA repair except for segregation of chromosomes. Recent studies show that topo IIβ provides opening of some genes on DNA during transcription and regulation of its expression. Especially there are intensive studies related to its roles in axon growth during neural differentiation. It was also reported that it is an essential enzyme for DNA repair mechanisms. Because of their differentiation potential, human mesenchymal stem cells (hMSCs) are open sources for using as model systems in researches and clinical applications. However due to the difficulties in obtaining of cells, factors that affect differentiation potential of cells in laboratory conditions which depends on the age of donor and limited cell division capacity give opportunity to use hMSC line in vitro studies rather than primer hMSCs. Differentiation process refers transcriptional regulation and changing phases in cell. Via in vivo and in vitro studies it has been determined that topo IIβ is an effective factor for this fact. In the literature studies has been focused on roles of topo IIβ in neural differentiation process but its probable and general role in other types of differentiation hasn't been studied. So, it is not clear if topo IIβ has a specialized function for neuronal cells or it has a general controlling factor involved in cell differentiation processes. By using this idea that is the starting point of study, effects of topo IIβ in transcription of genes involved in osteogenic differentiation pathway have been investigated. For this purpose it has been investigated that whether topo IIβ has effects in activation of osteoblastic genes' expression in hMSC line that has highly efficient osteogenic differentiation potential. In the study induced osteogenic differentiation process in hMSCs was conducted by using commercially available osteogenic differentiation factors. Osteogenic differentiation process has been confirmed via determining the presence of osteogenic markers by using histological stainings (Toluidine blue (TB), Alizarin red (AR)) and gene expression profiles at molecular level (BSP, OPN, OCN) via RT-qPCR (Real time quantitative polymerase chain reaction) technique. After confirmation of osteblastic cell population gain, studies of topo IIβ gene silencing via siRNA (small interfering RNA) method and overexpression via nucleofection technique at indicated time points were done. Experimental progression, which was started with the osteogenic differentiation in addition to the gene silencing and overexpression of topo IIβ, was only proceeded with topo IIβ silencing at last stage of experiments due to the observation of more reliable results in these groups. At last stage, in experimental conditions that were obtained with topo IIβ silencing and at indicated time points, comparison of genes related to osteogenesis and osteoporosis (OP) were done with PCR array technique. Groups used in experiments were composed as: hMSCs as control group which didn't have any treatments or osteogenic induction (NT-UD), osteogenically induced hMSCs (Ost), osteogenic induction in topo IIβ silenced hMSCs via specific siRNAs (Ost+siTopo IIβ) and osteogenic induction in topo IIβ overexpressed hMSCs (Ost+OE). siRNA induced silencing of topo IIβ caused decreasing effects in expression of related markers that were analyzed with several methods and progression of osteogenic differentiation at all indicated time points. In overexpression of topo IIβ due to the method that was used in transfection, hMSCs got into intense stress and caused cell death took long time of cells to be recovered and progression of osteogenic differentiation wasn't observed as planned. PCR array results that involved gene scannings related to osteogenesis and OP also showed that genes related to osteoblastic differentiation were negatively affected in topo IIβ silenced samples. In hMSCs that were committed into osteogenic differentiation alone, it has been shown that these genes were expressed quite a lot. As a result it has been shown that activity of topo IIβ is required in osteogenic differentiation of hMSCs and it is important for obtaining the osteoblastic cell population. Since the continuity of osteoblastic cell population is provided via cell differentiation process, determination of effective biological molecules and differential gene expression profile of hMSCs' osteogenic differentiation will be guided for both diagnosis and treatments of osteo-pathological disorders and contribute the detection of cell specific mechanisms of differentiation at molecular level. In this aspect study will be helpful and a source for similar studies and treatment based approaches.
Benzer Tezler
- Role of DNA Topoisomerase IIβ in Rho GTPase dependent axon growth through neural differentiation of human mesenchmal stem cells
İnsan mezenkimal kök hücrelerinin nöral farklılaşma sürecinde Rho GTPaz bağımlı akson büyümesinde DNA Topoizomeraz IIβ'nın rolü
MERVE ZAİM
- DNA topoizomeraz IIβ'nın nöroinflamasyondaki rolünün Parkinson hastalığı A53t α-sinüklein mutant transgenik fare modelinde araştırılması
Investigation of the role of DNA Topoisomerase IIβ in neuroinflammation in A53T α-synuclein mutant transgenic mice model
BERÇEM YEMAN KIYAK
Doktora
Türkçe
2024
BiyolojiSağlık Bilimleri ÜniversitesiMoleküler Tıp Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ MUSTAFA GANİ SÜRMEN
PROF. DR. SEVİM IŞIK
- Investigation the role of dna topoisomerase IIβ on the gene expression levels associated with parkinson's disease and neuroinflammation markers in an in vitro LPS and IFNγ-induced neuroinflammation model
Dna topoizomeraz IIβ'nin parkinson hastalığı ve nöroinflamasyon belirteçleri ile ilişkili gen ekspresyon seviyeleri üzerindeki rolünün in vitro LPS ve IFNγ kaynaklı nöroinflamasyon modelinde araştırılması
RAMA ŞEYHALİ
Yüksek Lisans
İngilizce
2024
BiyolojiÜsküdar ÜniversitesiMoleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SEVİM IŞIK
- The association of parkinson's disease with dna topoisomerase IIβ in neural-differentiated SH-SY5Y cell line
Parkinson hastalığı ile nöral farklılaşmış SH-SY5Y hücre hattında dna topoizomeraz IIβ ilişkisinin araştırılması
BERÇEM YEMAN
- LPS indüklü HMC3 mikroglia nöroinflamasyon modelinde Topo IIß gen ifadesinin susturulmasının incelenmesi
Investigation of silencing of Topo IIß gene expression in LPS-induced HMC3 microglia neuroinflammation model
MELİKE CANSEL EREN