Geri Dön

Transcriptional engineering of GAP promoter for improved recombinant protein production by Pichia pastoris

Transkripsiyon mühendisliği yöntemleriyle tasarlanan GAP promotoru altında Pichia pastoris ile rekombinant protein üretiminin geliştirilmesi

PDF İndir

  1. Tez No: 473247
  2. Yazar: ÖZGE ATA AKYOL
  3. Danışmanlar: PROF. DR. PINAR ÇALIK, PROF. DR. DIETHARD MATTANOVICH
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2017
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 369

Özet

Bu doktora tezinde, gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz başlatıcısının (promotor) (PGAP) üzerinde bulunan transkripsiyon faktörlerinin bağlanma bölgelerini transkripsiyon mühendisliği ile modifiye ederek rekombinant protein (r-protein) üretimini artırmak hedeflenmiştir. Pichia pastoris'te en çok kullanılan başlatıcılardan biri olan PGAP, olası transkripsiyon faktörlerinin (TF) bağlanma bölgeleri açısından analiz edilmiştir. Bulunan TF bağlanma bölgeleri silinerek ya da doğal konumlarında duplike edilerek PGAP varyant kütüphanesi oluşturulmuştur. Aynı zamanda, seçilen TF'ler aşırı-ekspres edilerek ya da silinerek, bu faktörlerin r-protein üretimine etkisi araştırılmıştır. Geliştirilen PGAP varyantları altında modifiye yeşil floresan proteini üretiminin ekspresyon seviyeleri, doğal PGAP'e kıyasla 0.35-3.10 kat arasında değişim göstermiştir. En yüksek ekspresyon seviyelerine ulaşan başlatıcı varyantları olan P9 (Gal4-benzeri TF bağlanma bölgesinin duplike edildiği) ve P10 (Rfx1 bağlanma bölgesinin silindiği) kontrolu altında ikinci model protein, rekombinant insan büyüme hormonu (rhGH) ekspres edilmiş; doğal PGAP'e kıyasla, sırasıyla, 2.4 ila 1.6 kat daha fazla rhGH üretilmiştir. Yarı-kesikli biyoreaktör işletim koşullarında, P9 kontrolü altında ve Gal4-benzeri TF'nin aşırı-ekspres edildiği suş ile rhGH üretiminde birim hücre başına 2.2-kat artış elde edilmiştir. Gal4-benzeri TF'nin aşırı-ekspresyonunun r-protein üretimine pozitif etkisinin yanısıra, Crabtree negatif olan P. pastoris hücrelerini Crabtree pozitif fenotipe çevirdiği ve spesifik glukoz tüketim hızını 1.7-kat, spesifik etanol üretim hızını ise 8-kat artırdığı bulunmuştur. Gal4-benzeri TF'nin metabolizma üzerindeki etkisini daha iyi anlamak için RNASeq ve 13C ile işaretlenmiş glukoz ile metabolik akı analizi yapılmıştır. Gal4-benzeri TF'nin aşırı ekspresyonunun pentoz fosfat yolizinin aşağı-regülasyonuna, aşağı-glikoliz yolizinin ise yukarı regülasyonuna sebep olduğu gösterilmiştir. Glikoliz yolizindeki akının artışı, metabolizmadaki akı dengesini bozarak fermentatif yolizine kaydırmıştır.

Özet (Çeviri)

The objective of this PhD thesis is to enhance the expression strength of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter (PGAP) for improved recombinant protein (r-protein) production through modifying the transcription factors (TF) that regulate the functioning of PGAP by transcriptional engineering. PGAP was analyzed in terms of putative TF binding sites. A synthetic library was constructed with distinct regulatory properties through deletion and duplication of these putative transcription factor binding sites and selected TFs genes were overexpressed or deleted to understand their roles on r-protein production. Using enhanced green fluorescent protein (eGFP) as the first model protein, an expression strength in a range between 0.35- and 3.10-fold of the wild-type PGAP was obtained in Pichia pastoris. Another model protein, recombinant human growth hormone (rhGH) was produced under control of selected promoter variants, i.e. P9 (Gal4-like binding site was duplicated) and P10 (Rfx1 binding site was deleted), and 2.4- to 1.6-fold higher product titers were reached compared to wild-type PGAP in 24 deep well plates, respectively. Finally, combining two approaches resulted in 2.2-fold increase in wet cell weight specific rhGH yield with P9 that was coupled with overexpression of a Gal4-like TF compared to PGAP in fed-batch bioreactor cultivation. In addition to its role on enhancing r-protein production under PGAP, the effect of overexpression of Gal4-like TF on central carbon metabolism of P. pastoris was investigated. The specific glucose consumption rate and ethanol production rates were increased by 1.7- and 8-fold in P. pastoris Gal4-like transcription factor overexpression mutants compared to wild-type P. pastoris, respectively. 13C labelled metabolic flux and RNASeq analyses results exhibited that overexpression of Gal4-like TF caused downregulation in pentose phosphate pathway and increased the fluxes through lower glycolysis pathway significantly. This higher and imbalanced glycolytic flux caused an overflow metabolism which triggered the fermentative pathway. Taken together, it was revealed that overexpression of Gal4-like transcription factor resulted in a switch from Crabtree negative to Crabtree positive behavior.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    232624

    Dynamic analysis of sumo conjugation cascade by molecular modeling and simulations

    Sumo konjugasyon basamaklarının moleküler modelleme ve siımulasyon ile incelenmesi

    EZGİ KARACA

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2008

    Kimya MühendisliğiBoğaziçi Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. TÜRKAN HALİLOĞLU

  2. Tez No

    507832

    Çinko nanotanecik içeren polimer nanokompozit malzeme üretimi ve karakterizasyonu

    Fabrication and characterization of polymer nanocomposite materials incorporated zno nanoparticles

    ALEV AKBAŞ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    Kimya Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SADRİYE KÜÇÜKBAYRAK OSKAY

  3. Tez No

    767606

    Pressed piano key detection and transcription by visual motion analysis

    Başlık çevirisi yok

    ALİ ÖZKAYA

    Yüksek Lisans

    İtalyanca

    İtalyanca

    2021

    Bilgisayar Mühendisliği Bilimleri-Bilgisayar ve KontrolPolitecnico di Milano

    DR. VİNCENZO CAGLİOTİ

  4. Tez No

    528513

    Transcriptional engineering of Pichia pastoris Alcohol dehydrogenase 2 and Alcohol oxidase 1 promoters for recombinant protein production

    Pichia pastoris Alkol dehidrojenaz 2 ve Alkol oksidaz 1 promotorlarının transkripsiyon mühendisliği ile rekombinant protein üretimi için geliştirilmesi

    BURCU GÜNDÜZ ERGÜN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

  5. Tez No

    741273

    Nicotiana benthamiana bitkisinde SUMO-G füzyon proteininin (small ubiquitin-like modifier domain ve rabies glycoprotein (G)) mühendisliği ve ekspresyonu

    Engineering and expression of SUMO-G fusion protein (small ubiquitin-like modifier domain and rabies glycoprotein (G)) in Nicotiana benthamiana plant

    ÖZNUR ÜLGEN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    BiyoteknolojiAkdeniz Üniversitesi

    Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. TARLAN MAMMEDOV

Geri Dön