Geri Dön

Transcriptional engineering of Pichia pastoris Alcohol dehydrogenase 2 and Alcohol oxidase 1 promoters for recombinant protein production

Pichia pastoris Alkol dehidrojenaz 2 ve Alkol oksidaz 1 promotorlarının transkripsiyon mühendisliği ile rekombinant protein üretimi için geliştirilmesi

PDF İndir

  1. Tez No: 528513
  2. Yazar: BURCU GÜNDÜZ ERGÜN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. PINAR ÇALIK
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2018
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 336

Özet

Doktora tezinin amacı rekombinant protein (r-protein) üretiminin artırılması için güçlü, etanol ile regüle edilen promotor varyantlarının tasarlanması ve geliştirilmesi, ve belirlenen transkripsiyon faktörlerinin (TF) P. pastoris ADH2 (PADH2) ve AOX1 (PAOX1) promotorlarının regülasyonunda rollerinin araştırılmasıdır. PADH2 promotor mimarisi nükleozom optimizasyonu ve transkripsiyon faktörü bağlanma bölgelerinin modifikasyonu ile değiştirilmiş, etanolün karbon ve enerji kaynağı olarak kullanılacağı PAOX1 indüksiyon mekanizması yeniden tasarlanmıştır. Adr1 (Mxr1), Aca2, Cat8, ve TATA bağlanma motifleri PADH2 ve PAOX1 promotor varyantlarını içeren kütüphanelerinin tasarlanması ve oluşturulmasında kullanılmıştır. Geliştirilen yeni promotor varyantlarının güçleri ilk aşamada farklı fermentasyon ortamlarında hücre içi model protein, güçlendirilmiş yeşil floresan protein (eGFP) üretimi ile araştırılmıştır. Doğal PADH2'ye göre, PADH2 varyantları %476 daha fazla eGFP sentezi gerçekleştirmiştir. PAOX1 varyantları etanol indüksiyonu koşulunda doğal promotorun (PAOX1-wt) %74'ü ile %130'u arasında aktivite göstermiş, methanol indüksiyonu altında PAOX1-wt'in %197'si kadar eGFP üretimi gerçekleştirmiştir. eGFP transkript düzeylerinin ölçümü ile geliştilen promotor varyantları PADH2-OptCat, PADH2-NucOpt, PADH2-AddCat, PADH2-NucOpt-OptCat, PAOX1-Cat3, PAOX1-Aca, ve PAOX1-mod'un güçlendirilmiş transkripsiyon kapasiteleri doğrulanmıştır. Geliştirilen promotor varyantlarının potansiyellerinin değerlendirilmesi için öne çıkan üç promotor varyantı PADH2-NucOpt, PADH2-OptCat, ve PAOX1-mod ile hücre dışı serum albumin üretimi (hSA) gerçekleştirilmiştir. Etanol indüksiyonu ile fermentasyon deneylerinde, PADH2-wt, PADH2-NucOpt, PADH2-OptCat, ve PAOX1-mod promotor varyantları altında sırası ile birim yaş hücre ağırlığı başına üretilen ortalama hücredışı hSA verim katsayıları (YP/X) 0.26, 0.38, 1.13, ve 0.48 mg/g olarak hesaplanmıştır. Metanol içeren tanımlı besiyerinde PAOX1-wt ve PAOX1-mod ile YP/X değerleri 0.85 ve 1.34 mg/g olarak bulunmuştur. Adr1 (Mxr1), Aca1, Cat8-1, ve Cat8-2 transkripsiyon faktörlerinin PADH2 ve PAOX1 regülasyonunda rollerinin belirlenmesi için TF aşırı üreten (OE) ve TF genin silindiği (KO), PADH2 ve PAOX1 kontrolünde eGFP üreten suşlar geliştirilmiştir. Limitli glikoz ve yüksek derişimde gliserol içeren ortamlarda, Cat8-2 aşırı üretildiğinde PADH2, etanol ile indüklenmiş hücrenin, 37% ve 33%'ü kadar eGFP sentezi yapabilmektedir. PADH2'nin aktivitesi cat8-1Δ suşu ile etanol indüksiyonu altında %128'e; adr1Δ suşu ile methanol indüksiyonunda %183'e yükselmiştir. Adr1 aşırı üreten hücrelerde, metanol indüksiyonu altında PAOX1 aktivitesi %345'e yükselmiştir. Etanol ve methanol ile indüklenen ve Adr1'i aşırı üreten hücrelerde PAOX1-mod ekspresyon gücü sırasıyla doğal promotorun %444 ve %383'üne yükselmiştir. Geliştirilen yeni promotor varyantları ve transkripsiyon mühendisliği ile tasarlanan r-protein üretim platformlarının endüstriyel r-protein üretim prosesleri için yüksek potansiyele sahip adaylar olduğu elde edilen sonuçlarla kanıtlanmıştır.

Özet (Çeviri)

The aim of the Ph.D. thesis is designing and engineering novel promoter variants to obtain strong ethanol regulated promoters for improved recombinant protein production, and to clarify the role of certain transcription factors (TFs) on the regulation of P. pastoris ADH2 (PADH2) and AOX1 (PAOX1) promoters. Promoter architecture of PADH2 was altered by nucleosome optimization and modification of transcription factor binding sites and, PAOX1 was engineered and its induction mechanism was redesigned for use of ethanol as carbon and energy source. Adr1 (Mxr1), Aca2, Cat8, and TATA-binding motifs were used in the design and construction of PADH2 and PAOX1 promoter libraries. The strengths of the novel engineered promoter variants (NEPVs) were investigated initially with the intracellular synthesis of the model protein engineered green fluorescent protein (eGFP) under different fermentation conditions. Engineered PADH2 allowed a 476% increase in eGFP synthesis compared to that of PADH2-wt. Engineered PAOX1-v spanning an activity range between 74% and 130% of the wild-type PAOX1 (PAOX1-wt) in fermentations in ethanol which allows a 197% increase in eGFP synthesis in fermentations using methanol. Subsequent measurements of the eGFP transcript levels confirmed stronger transcriptional capacities of the NEPVs, namely, PADH2-OptCat, PADH2-NucOpt, PADH2-AddCat, PADH2-NucOpt-OptCat, PAOX1-Cat3, PAOX1-Aca, and PAOX1-mod. In order to test the potential of the prominent NEPVs, extracellular human serum albumin (hSA) production also was studied with the three promising NEPVs, i.e., PADH2-NucOpt, PADH2-OptCat, and PAOX1-mod. Average extracellular hSA yield per gram of wet-cell-weight (YP/X) was 0.26, 0.38, 1.13, and 0.48 mg/g with PADH2-wt, PADH2-NucOpt, PADH2-OptCat, and PAOX1-mod, respectively under ethanol induction. In methanol-based defined medium with PAOX1-wt and PAOX1-mod YP/X was calculated as 0.85 and 1.34 mg/g, respectively. In order to clarify the role of the TFs in the regulation of PADH2 and PAOX1, overexpression and knock-out strains of Adr1 (Mxr1), Aca1, Cat8-1, and Cat8-2 were developed for the synthesis of eGFP under PADH2 and PAOX1 variants. Cat8-2 overexpression led to PADH2 activation under limited glucose and excess glycerol conditions, in that PADH2-wt reached respectively 37% and 33% eGFP production capacity of the ethanol-induced wild-type strain. Expression strength of PADH2 increased to 128% in cat8-1Δ strain with ethanol induction and 183% in adr1Δ strain with methanol induction. Under methanol induction, overexpression of Adr1 increased the PAOX1 activity to 345% activity of wild-type. In ethanol and methanol-induced Adr1 overexpression strains, the NEPV PAOX1-mod increased the expression strength to 444% and 383% of the expression strength of methanol induced PAOX1-wt, respectively. It is conclusively demonstrated that the NEPVs and transcriptionally engineered r-protein expression platforms are promising candidates for industrial r-protein production processes.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    688163

    Effects of metabolic engineering of ethanol utilization pathway in Pichia pastoris on recombinant protein production and transcription levels in central metabolism

    Pichia pastoris'in etanol tüketim yolunda yapılan metabolik mühendisliğinin rekombinant protein üretimi ve merkezi metabolizmadaki transkripsiyon düzeylerine etkisi

    İDİL DAYANKAÇ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. HASAN TUNÇER ÖZDAMAR

  2. Tez No

    473247

    Transcriptional engineering of GAP promoter for improved recombinant protein production by Pichia pastoris

    Transkripsiyon mühendisliği yöntemleriyle tasarlanan GAP promotoru altında Pichia pastoris ile rekombinant protein üretiminin geliştirilmesi

    ÖZGE ATA AKYOL

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. DIETHARD MATTANOVICH

  3. Tez No

    884957

    Farklı karbon kaynağı ve besiyeri pH değerinin Pichia pastoris mayasının rekombinant protein üretimine olan etkisinin incelenmesi

    Investigation of the effect of different carbon sources and media pH values on recombinant protein production of Pichia pastoris yeast

    MERVE GÜLTEN AKBABA

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    Gıda MühendisliğiHarran Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET KARAASLAN

  4. Tez No

    430019

    Gıda katkı maddesi olarak kullanılabilecek rekombinant jelatin üretimi için COL1A1 gen fragmanlarının maya sisteminde (Pichia pastoris) transkripsiyonu

    Transcription of COL1A1 gene fragmans in yeast system (Pichia pastoris) for production of recombinant gelatin used as food additive

    AYTEN GÜLLÜCE

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2016

    BiyoteknolojiErciyes Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ZÜLAL KESMEN

  5. Tez No

    741273

    Nicotiana benthamiana bitkisinde SUMO-G füzyon proteininin (small ubiquitin-like modifier domain ve rabies glycoprotein (G)) mühendisliği ve ekspresyonu

    Engineering and expression of SUMO-G fusion protein (small ubiquitin-like modifier domain and rabies glycoprotein (G)) in Nicotiana benthamiana plant

    ÖZNUR ÜLGEN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    BiyoteknolojiAkdeniz Üniversitesi

    Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. TARLAN MAMMEDOV

Geri Dön