Geri Dön

Influence of microenvironment on tissue engineering applications

Mikroçevrenin doku mühendisliği uygulamalarına etkisi

PDF İndir

  1. Tez No: 474880
  2. Yazar: ESEN SAYIN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. VASIF NEJAT HASIRCI, DOÇ. DR. ERKAN TÜRKER BARAN
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2017
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 190

Özet

Hem olgun hem de kök hücreleri yönlendiren mikroçevre kaynaklı işaretler, doku mühendisliği yapılarının başarısını belirlemektedir. Bu beklentiyi ispatlamak ve vurgulamak için, yüzey topoğrafyası, iskele (hücre taşıyıcı, scaffold) kimyası, 2 boyuta karşı 3 boyutlu mikroçevreler ve mekanik uyarım gibi çeşitli parametreler mikroçevreye dahil edilmiştir. Fotolitografik olarak üretilen mikro desenlere sahip silikon çiplerden kopyalanan poli(dimetilsiloksan) (PDMS) kalıpları kullanılarak sütun ve kanallı iki adet farklı fiziksel işaret içeren yüzeyler çözücü uçurma yöntemi ile kollajen tip I ve ipek fibroini biyopolimerlerinden üretilmiştir. Bombyx mori ipek fibroini ve kollajen tip I proteini ile optimum mekanik özellikler ve biyobozunma elde etmek için karıştırılmıştır. Adipöz kaynaklı kök hücreleri (ADSCs) mikrokanal ve mikrosütun desenli kollajen-ipek fibroini filmlerinin üstünde hücre morfolojisindeki değişimlerin osteojenik farklılaşmaya olan etkisini araştırmak için kültür edilmiştir. Yüksek mikrosütun desenli film üstünde yüksek ADSC çoğalma profili elde edilirken, ancak mikrokanal desenli filmler iki kat daha yüksek en-boy oranına ve hücrelerin etkili yönlendirilmesine neden olmuştur. ADSC'lerin alkalin fosfataz aktivitesi ölçülen aktiviteler hücre sayısına göre normalize edildiğinde, mikrokanal yüzeyinde sütunlara oranla birkaç kat daha yüksek olduğunu göstermiştir. Desenli ve desensiz filmlerle kültür sonrasında verimli bir etkili kollajen tip I ve mineral birikimi gözlemlenmiş ve bu ekstraselüler matriks (ECM) bileşenlerinin mikrokanalların ekseni boyunca yönlendirilmesini sağlanmıştır. Mikrokanal topografyayla birlikte kollajen-fibroin karışım filmi kullanımı, en-boy oranını ve hücre hizalamasını önemli ölçüde arttırmış ve ADSC'lerin osteojenik kökene farklılaştırılmasında da etkili olmuştur. Mikroçevreyi tanımlayan unsurlara ek bir biyokimyasal işaret olarak, anizotropik hücre büyümesi ve kemik oluşumunu uyarmak için mikrokanal desenleri taşıyan kollajen-ipek fibroin karışımı filmlerine hidroksiapatit biriktiren amino asit dizisine sahip elastin benzeri rekombinant proteini (ELR) dahil edilmiştir. Hücresiz filmlerin Elastik Modülü ve maksimum gerilme mukavemeti (UTS) sırasıyla 0.58 ± 0.13 MPa ve 0.18 ± 0.05 MPa ölçülmüştür. 28 günlük hücre kültüründen sonra ADSC ekilmiş filmlerin Elastik Modülü 1.21 ± 0.42 MPa ve UTS'i 0.32 ± 0.15 MPa olup ve bu değerler insan osteoblast (HOB) ekilmiş filmlerden yaklaşık 3 kat fazladır. Elastik Modülündeki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p = 0.02). ADSC'ler, filmler üzerine HOB'lardan daha iyi tutunmuş ve çoğalmış ve daha çok kalsiyum fosfat minerali üretmiştir. Bu sonuçların ışığında ADSC'ler bu çalışmada kullanılan kollajen-fibroin-ELR tabanlı yapıların kemik dokusu mühendisliği için HOB'lardan daha iyi bir hücre kaynağı olarak görev yapmıştır. In vitro sistemler genel olarak 2 boyutlu test ortamına dayanırken in vivo ortam en iyi 3 boyutlu test ortamı ile taklit edilebilmektedir. Bu durum önemlidir çünkü doku mühendisliği ile üretilmiş olan ürünün olgunlaşması 2 boyutlu yüzeyin üzerinde etkileşimlerin tipi nedeniyle farklı olmalıdır ve 2 boyutlu ve 3 boyutlu sistemlerde moleküler sinyallerin birikiminin farklı olması beklenmektedir. 3 boyutlu iskeleler uzun film şeritlerini bir çubuk üzerinde spiral oluşturmak üzere yuvarlayarak yapılmış ve 2 boyutlu, spiral olmayan, filmlerle karşılaştırılarak mezenkimal kök / multipotent stroma hücrelere (MSC'ler) 3 boyutlu mikroçevrenin katkılarını araştırmak için tasarlanmıştır. Ek olarak, hipoksiya ve artere ait oksijen basıncının katkısı, MSC'lerin ve osteoblast nişinin oksijen açısından sınırlı mikroçevre kavramı çerçevesinde çalışılmıştır. Hipoksiya, MSC'lerin TCPS ve 2D iskele üzerinde iken kök hücre özelliğini korumasını sağlamıştır. İlginç olan bir nokta ise MSC'ler 3 boyutlu yapıda normoksik koşullarda kök hücre özelliğini korurken VEGFA ve osteojenik farklılaşma düzeyini yükseltmiştir. Dikkat çekici bir şekilde, normoksiya koşulunda osteojenik ve anjiyojenik gen ifadeleri, 3 boyutlu yapıda 2 boyutlu iskeleye kıyasla sırasıyla 13200 ve 266 kat daha fazla ölçülmüştür. Test edilen bütün oksijen seviyelerinde MSC'ler tarafından daha az tercih edilen 2 boyutlu iskelelerde UTS hücresiz örneklere yakın bulunmuştur. Bundan farklı olarak, hipoksiyadan normoksiyaya geçiş esnasında, MSC'lerin ECM'lerini 3 boyutlu iskele yüzeyine salgılamaları ile yaptıkları katkı sayesinde 3 boyutlu iskelelerinin Elastik Modülü ve UTS'si sırasıyla 1.13 ± 0.33 MPa'dan 2.16 ± 0.81 MPa'ya ve 0.51 ± 0.12 MPa'dan 1.82 ± 0.27 MPa'ya yükselmiştir. MSC çoğalması kollajen hidrojel içinde olan iskeleler üzerinde hem oksijen seviyesi hem de dinamik olarak, tekrarlı gerilime (% 10) bağımlı olduğu gösterilmiştir. Diğer bir taraftan, gerilim MSC'lerin şeklini uygulanan kuvvet yönünde uzatmış ve aynı zamanda hipoksiya ve normoksiyada anjiyojenik aktiviteyi engellemiştir. Özet olarak, bu çalışma, kemik ECM'sini taklit etmenin, mikrokanallı desenlerin özellikle 2 boyutlu substratların sınırlamalarını aşan 3 boyutlu mikroçevreler içinde kullanılması yoluyla ile mümkün olduğunu göstermiştir. Normoksik ve oksijeni sınırlı fizyolojik ortamların ikisinde de, 2 boyuttan 3 boyutlu mikroçevreye geçiş MSC'lerin osteojenik ve anjiyojenik aktivitelerini ve gerilim mekanik özelliklerini arttırmıştır.

Özet (Çeviri)

Cues of microenvironment that guide both mature and stem cells determine the success of tissue engineered constructs. To prove and emphasize this expectation, various parameters such as surface topography, scaffold (cell carrier, scaffold) chemistry, 2D vs 3D microenvironments and mechanical stimulation were included into the microenvironment. Surfaces with two distinct physical cues pillar and groove-ridge type micropatterns were transferred to the surfaces of the films by casting the collagen type I and silk fibroin biopolymers on poly(dimethylsiloxane) (PDMS) templates which were replicated from photolithographically produced micropatterns on silicon wafers. Bombyx mori silk fibroin a structural biopolymer, was blended with collagen type I protein, to obtain high mechanical properties and biodegradability. Adipose derived stem cells (ADSCs) were cultured on collagen–silk fibroin films with microchannel and micropillar patterns to investigate the effects of cell morphology changes on osteogenic differentiation. While higher ADSC proliferation profiles were obtained on micropillar patterned film, microchannel patterned films, however, caused twice higher aspect ratio and effective orientation of cells. Alkaline phosphatase activity of ADSCs was several times higher on microchannel surface when the measured activities were normalized to cell number. Effective deposition of collagen type I and mineral after cell culture was observed for patterned and unpatterned films and these extracellular matrix (ECM) components were oriented along the axis of the microchannels. The use of collagen–fibroin blend film with microchannel topography increased the aspect ratio and alignment of cells significantly, and it was also effective in the differentiation of ADSCs into osteogenic lineage. As an additional biochemical cue of microenvironment defining element, elastin-like recombinamer (ELR) with a hydroxyapatite depositing amino acid sequence was incorporated into films of collagen-silk fibroin blend carrying microchannel patterns to stimulate anisotropic cell growth and osteogenesis. The Young's modulus and the ultimate tensile strength (UTS) of unseeded films were 0.58 ± 0.13 MPa and 0.18 ± 0.05 MPa, respectively. After 28 days of cell culture, ADSC seeded films had a Young's modulus of 1.21 ± 0.42 MPa and UTS of 0.32 ± 0.15 MPa which were about 3 fold higher than human osteoblast (HOB) seeded films. The difference in Young's modulus was statistically significant (p = 0.02). ADSCs attached, proliferated and produced calcium phosphate mineral on films better than the HOBs. In the light of these results, ADSCs served as a better cell source than HOBs for bone tissue engineering of collagen-fibroin-ELR based constructs used in this study. In vitro systems generally rely on 2D test media whereas in vivo can best be mimicked if a 3D test medium is used. This is important because the maturation of a tissue engineered product should be different than on a 2D surface due to the kind of interactions and the accumulation of molecular signals in 2D and 3D systems are expected to be different. 3D scaffolds were created by folding long strips of engineered films on a rod to investigate the contributions of 3D microenvironment over mesenchymal stem / multipotent stromal cells (MSCs) by comparing with 2D films. Additionally, the contribution of hypoxia and arterial oxygen pressure was studied further to look into the concept of oxygen limited microenvironments of the native MSCs and osteoblast niche. Hypoxia maintained the stemness of the MSCs on TCPS and 2D scaffold. Interestingly, MSCs had elevated VEGFA level and osteogenic differentiation on 3D construct while preserving their stemness at normoxic conditions. Strikingly, osteogenic and angiogenic marker expressions were 13200 and 266 fold higher, respectively on 3D construct than 2D scaffold at 21% oxygen. At all of the oxygen tensions that were tested, UTS was found to be similar with the unseeded scaffolds at less preferable 2D scaffolds by MSCs. Distinctively, during the transition from hypoxia to normoxia, Young's modulus and UTS of the MSC seeded 3D scaffolds were enhanced from 1.13 ± 0.33 MPa to 2.16 ± 0.81 MPa and 0.51 ± 0.12 MPa to 1.82 ± 0.27 MPa, respectively, owing to the contribution of cells by secreting their ECM onto the surface of 3D scaffold surface. MSC proliferation was dependent both on oxygen tension and cyclic strain exposure (10%) on collagen hydrogel embedded scaffolds. On the other hand, strain was able to alter MSC shape by elongating them on the force direction and inhibit angiogenic activity both at hypoxia and normoxia. In summary, this study showed that mimicking the bone ECM was possible through the use of microchannel patterns especially in 3D microenvironments that overcome the limitations of 2D substrates. The transition from 2D to 3D microenvironment enhanced the osteogenic and angiogenic activity of MSCs and along with the tensile properties both at normoxia and oxygen limited physiological environments.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    442133

    Influence of micropatterns on human mesenchymal stem cell fate

    Mikrodesenlerin insan mezenkimal kök hücrelerinin yazgısı üzerine etkileri

    ONUR HASTÜRK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    BiyomühendislikOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. VASIF NEJAT HASIRCI

    PROF. DR. NESRİN HASIRCI

  2. Tez No

    437989

    Bone surface microenviroment mimicked biodegredable scaffolds for osteogenic stem cell differentiation

    Kemik mikroçevre taklit biyobozunur doku iskeleleri ile ostjenik kök hücre farklılaşmaşı

    BİRGÜN ÖZÇOLAK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    BiyokimyaBoğaziçi Üniversitesi

    Biyomedikal Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. BORA GARİPCAN

  3. Tez No

    374357

    Bioactive porous peg-peptide composite hydrogels with tunable mechanical properties

    Mekanik özellikleri ayarlanabilir biyoaktif poroz peg-peptit kompozit hidrojellerin üretimi

    MELİS GÖKTAŞ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2014

    Biyomühendislikİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Malzeme Bilimi ve Nanoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MUSTAFA ÖZGÜR GÜLER

  4. Tez No

    851894

    Bioelectronic systems in studying tissue engineering, real-time biophysical monitoring of birds and point-of-care diagnostics

    Doku mühendisliğinde, kuşların gerçek zamanlı biyofiziksel izlenmesinde ve hasta-başı tanı uygulamalarında biyoelektronik sistemler

    ABDURRAHMAN GÜMÜŞ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    BiyomühendislikCornell University

    Elektrik-Elektronik ve Bilgisayar Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. DAVID ERICKSON

  5. Tez No

    591513

    Laser ablation assisted size-based sorting of pure water droplets inside a microfluidic chip and designing a microfluidic chip for studying sprouting angiogenesis

    Lazer işleme ile geliştirilen mikroakışkan çip içerisinde su damlalarının boyutlarına bağlı sınıflandırılması ve anjiyojenez çalışmalarına yönelik mikroakışkan çip tasarımı

    ATEEQ UR REHMAN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    BiyomühendislikKoç Üniversitesi

    Biyomedikal Bilimler ve Mühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ALPER KİRAZ

Geri Dön