Characterisation of immobilised Geobacillus stearothermophilus L-arabinose isomerase
İmmobilize Geobacillus stearothermophılus L-arabinoz izomeraz'ın karakterizasyonu
- Tez No: 488145
- Danışmanlar: PROF. DR. SEVİL YÜCEL
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyomühendislik, Biyoteknoloji, Biyokimya, Bioengineering, Biotechnology, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2017
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Yıldız Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyomühendislik Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Düşük kalorili bir tatlandırıcı çeşidi olan D-tagatoz'un üretimi için Geobacillus stearothermophilus mikroorganizmasından elde edilen L-arabinoz izomeraz ile ilgili bir çalışma yapılmıştır. Endüstriyel olarak D-tagatoz, gelinen en son aşamada, ancak kimyasal yöntemlerle üretilebilmektedir. Fakat bu yolla da pek çok yan ürün ve atıklar meydana gelmektedir. Biyolojik yoldan D-tagatoz'un üretimi ticari açıdan henüz daha mümkün olabilmiş değildir. Yapılan bu çalışmada ilk olarak L-arabinoz izomeraz hücresel olarak E.Coli'ye iletilmiştir. Enzimin de sonrasında saflaştırılması ve izolasyonu yapılmıştır. Bu sayede de üç farklı L-arabinoz izomeraz fraksiyonu elde edilmiş olup, bunlar da sırasıyla; intrasellüler enzim, ham ekstrakt ve saflaştırılmış enzim şeklindedir. Bu çalışma, doğal Geobacillus stearothermophilus dan olan immobilize edilmiş üç farklı enzim fraksiyonunun sistematik bir yaklaşım dahilindeki karakterizasyonunda ve karşılaştırılmasında bir ilki teşkil etmektedir L-arabinoz izomeraz'ın aktivitesi, enzimin saflaştırılması ve izolasyonu sırasında açığa çıkartılmış olan üç farklı enzim fraksiyonu için ayrı ayrı hesaplanmıştır. L-AI aktivitesi intrasellüler enzim, ham ekstrakt ve saflaştırılmış enzim için sırasıyla 8.55 ± 0.13 U/ml, 7,95 ± 0.03 U/ml ve 6.75 ± 0.06 U/ml şeklindedir. Ardından, imobilizasyon işleminden önce olmak üzere, intrasellüler enzim ve ham ekstrakt, saflaştırılmış enzim ile aynı protein konsantrasyonuna getirilmek amacıyla seyreltilmişlerdir. Seyreltilmiş intrasellüler enzim, seyreltilmiş ham ekstrakt ve saflaştırılmış enzim, imobilizasyon işlemi öncesinde 60°C sıcaklıkta ve pH 7.0 de dönüşümsel bir deneye tabi tutulmuşlardır. 48 saat inkübe edildikten sonra D-tagatoz konsantrasyonu sırasıyla 67.2 ± 0.8 g/l, 61.3 ± 3.2 g/l ve 68.7 ± 2.2 g/l şeklinde bulunmuştur. Bu sayede tüm enzim fraksiyonları için D-tagatoza olan bu dönüşüm ispatlanmıştır. Sonrasında, üç tane olarak elde edilmiş bulunan birbirinden farklı enzim fraksiyonları aljinat boncukları içerisine hapsedilmiş ve bu sayede D-galaktoz'un D-tagatoza olan dönüşümü için gerekli olan optimum sıcaklık ve optimum pH değerleri tespit edilmiştir. Bu deneyler serisi 50°C ile 90°C arası sıcaklık değerlerinde ve pH 7.0 'de gerçekleştirilmiştir. Optimum pH hesaplanmasında da, pH 5.0 ile pH 9.0 arasındaki değerlerle çalışılmıştır. Bunun yanı sıra D-tagatoz konsantrasyonu sistein – karbazol metodu ile tayin edilmiştir. Üç tane farklı immobilize edilmiş olan enzim fraksiyonları, üçü de aynı olacak şekilde 80°C optimum sıcaklık değeri göstermişlerdir. 80°C ve pH 7.0 de gerçekleştirilen beş saatlik bir inkübasyon sonunda D-tagatoz konsantrasyonları 54.2 ± 0.5 g/l, 27.9 ± 1.2 g/l ve 36.1 ± 1.0 g/l olarak sırasıyla seyreltilmiş intrasellüler enzim, seyreltilmiş ham ekstrakt ve saflaştırılmış enzim için elde edilmiştir. Farklı boncuklar için de optimum pH 6.5 olacak şekilde bulunmuştur. 60°C ve pH 6.5 de gerçekleştirilen 5 saatlik inkübasyonun ardından da D-tagatoz konsantrasyonları 23.2 ± 0.3 g/l, 10.5 ± 0.3 g/l and 13.2 ± 0.3 g/l olarak sırasıyla seyreltilmiş intrasellüler enzim, seyreltilmiş ham ekstrakt ve saflaştırılmış enzim için hesaplanmıştır. Bu çalışmada ortaya çıkan sonuçlara göre, aljinat boncuklarına hapsedilmiş intrasellüler enzim, ham ekstrakt ve saflaştırılmış enzimin hepsi, D-galaktoz'un D-tagatoz'a dönüşümü için aynı optimum şartlara sahiptirler. Her bir fraksiyon için ayrı olarak optimum sıcaklık ve pH değerleri 80°C ve 6.5 olarak sırasıyla elde edilmiştir. Bu bulgular, D-galaktoz'un D-tagatoz'a olan biyolojik dönüşümünde bilgi verici olacaktır. Ayrıca bu, D-tagatoz'un üretimi için, Geobacillus stearothermophilus dan immobilize L-AI ın verimliliğinin ve stabilitesinin geliştirilmesindeki büyük bir araştırmanın da ilk adımıdır.
Özet (Çeviri)
The L-arabinose isomerase from Geobacillus stearothermophilus was studied for the production of D-tagatose, a low-calorie bulk sweetener. Industrially, D-tagatose is only produced in a chemical way. However, a lot of waste and by-products are formed in this way. A biological synthesis of D-tagatose is not yet commercially available. In this work first, L-arabinose isomerase was intracellularly expressed in E. coli. The enzyme was isolated and purified. Hereby, three different L-arabinose isomerase fractions were obtained, namely the intracellular enzyme, crude extract and purified enzyme. This work is first to characterise and compare three different immobilised enzyme fractions from wild type Geobacillus stearothermophilus in a systematic approach. The L-AI activity was determined of the different enzyme fractions obtained during the isolation and purification. The L-AI activity in the intracellular enzyme, crude extract and purified enzyme were 8.55 ± 0.13 U/ml, 7.95 ± 0.03 U/ml and 6.75 ± 0.06 U/ml, respectively. Furthermore, prior to immobilisation, the intracellular enzyme and crude extract were diluted to the same protein concentration as the purified enzyme. The diluted intracellular enzyme, diluted crude extract and purified enzyme were prior to the immobilisation experiment, subjected to a conversion experiment at 60°C and pH 7.0. After 48 hours of incubation, D-tagatose concentrations of 67.2 ± 0.8 g/l, 61.3 ± 3.2 g/l and 68.7 ± 2.2 g/l were found, respectively. Conversion to D-tagatose was proven for all the enzyme fractions. Next, the three enzyme fractions were entrapped in alginate beads and the optimal temperature and pH for the conversion of D-galactose to D-tagatose were determined. Experiments were carried out with temperatures ranging from 50 to 90°C at a pH of 7.0. For the optimal pH, experiments were carried out from pH 5.0 to pH 9.0. The D-tagatose concentrations were determined using cysteine-carbazole method. The different immobilised enzyme fractions showed an optimal temperature of 80°C. After 5 hours of incubation at 80°C and pH 7.0, a D-tagatose concentration of 54.2 ± 0.5 g/l, 27.9 ± 1.2 g/l and 36.1 ± 1.0 g/l was obtained for the diluted intracellular enzyme, diluted crude extract and purified enzyme, respectively. The optimal pH was 6.5 for the different beads. After 5 hours of incubation at 60°C and pH 6.5, a D-tagatose concentration of 23.2 ± 0.3 g/l, 10.5 ± 0.3 g/l and 13.2 ± 0.3 g/l was obtained for diluted intracellular enzyme, diluted crude extract and purified enzyme, respectively. The results within this study revealed that intracellular enzyme, crude extract and purified L-arabinose isomerase entrapped in alginate beads have the same optimal operational conditions for the conversion of D-galactose into D-tagatose. An optimal temperature and pH of 80°C and 6.5 were determined for each fraction individually. These findings will be useful for the biological conversion of D-galactose to D-tagatose. This is a first step of a bigger research to improve the productivity and stability of immobilised L-AI from Geobacillus stearothermophilus for the production of D-tagatose.
Benzer Tezler
- Anoxybacillus caldiproteolyticus ve geobacillus stearothermophilus ile modifiye edilmiş amberlit xad-16 reçinesi kullanılarak cd(II) iyonunun biyosorpsiyonu, önderiştirilmesi ve faas ile tayini
Biosorption, preconcentration, and determination of cd (II) ion, using amberlite xad-16 resin modified with anoxybacillus caldiproteolyticus and geobacillus stearothermophilus through faas
BARIŞ ENEZ
- Ankara koşullarında yetiştirilen yabancı kökenli bazı üzüm çeşitlerinin ampelografik özelliklerinin belirlenmesi üzerinde araştırmalar
Description of the ampelographic characters of some introduced grape varieties grown in Ankara conditions
İBRAHİM DEMİR
- Effect of membrane fluidity on binding of 125I-Insulin to sheep liver membrane receptors
Başlık çevirisi yok
HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM
