Geri Dön

NAD+ bağımlı mutant Candida methylica format dehidrogenaz enzimine ait katalitik bölgenin protein mühendisliği temelli analizi

Protein engineering based analsis of the catalytic domain of NAD+ dependent mutant Candida methylica formate dehydrogenase

PDF İndir

  1. Tez No: 492618
  2. Yazar: UĞUR PALA
  3. Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. BARIŞ BİNAY
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyokimya, Biyomühendislik, Biochemistry, Bioengineering
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2018
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Gebze Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 61

Özet

Endüstride, optikçe aktif, değerli, kiral farmasötik ara bileşiklerin ve kimyasalların sentezinde kullanılan enzimler, kofaktör olarak oldukça pahalı olan NAD(P)H' ın kullanımına ihtiyaç duyarlar. Bu nedenle reaksiyonda kullanılan NAD(P)H' ın geri dönüşümünün sağlanması, maliyeti düşürmek için çok önemlidir. Dehidrogenazlar, bu kofaktörlerin yenilenmesini sağlamaları sebebi ile bu tür çalışmalar için çok değerli enzimlerdir. Bu tip enzimlerden olan NAD+- bağımlı format dehidrogenaz (FDH) (EC 1.2.1.2), format iyonunun (HCOO-), karbondiokside (CO2) yükseltgerken, NAD+ iyonunun da NADH' e indirgenmesini katalizler. Bu çalışmada, NAD+- bağımlı Candida methylica format dehidrogenaz (CmFDH) enzimine ait katalitik bölgenin protein mühendisliği yöntemlerinden biri olan yarı-rasyonel yaklaşım tekniği ile analizi amaçlanmıştır. Bu amaç ile, enzimin aktif bölgesinde yer aldığı düşünülen 119. pozisyondaki asparajine tekrarlamalı doygunluk mutajenezi uygulamak için dejeneratif kodonlu primerler tasarlanmış, mutant kütüphanesi oluşturulmuş ve 150 koloni taranmıştır. Otoindüksiyon-Studier besiyerinde E.Coli BL21 (DE3) hücrelerinde ifade edilmesi sağlanan, yabanıl tip ve mutant CmFDH' lar, Ni-NTA HisTrap kolonu kullanılarak saflaştırılmıştır. Enzimlerin formata karşı aktivite ölçümleri yapılmıştır. Format ve NAD+ substrat olarak kullanılıp kararlı hal kinetik çalışmaları gerçekleştirilerek, Michaelis-Menten kinetik değerler hesaplanmıştır. Elde edilen mutantlardan N119R, N119D, N119G ve N119C mutant CmFDH' lar formata karşı ölçülebilir bir aktivite göstermemiştir. Yabanıl tip ile kıyaslandığında, N119Y mutant CmFDH' ın katalitik verimliliğinde bir miktar artış ve N119H mutant CmFDH' ın katalitik verimliliğinde ise ciddi bir düşüş görülmüştür. Elde edilen bu sonuçlar, 119. pozisyondaki asparajinin katalitik aktivite için fonksiyonel bir amino asit olduğunu göstermiştir. Bu pozisyona atanan yeni amino asitlerin, substrat ile olan etkileşiminin görülmesi ve enzimin aktivitesindeki rolünün daha detaylı anlaşılması için modelleme çalışmaları halen devam etmektedir.

Özet (Çeviri)

In industrial applications, enzymes are used in the synthesis of optically active, chiral pharmaceutical intermediates and chemicals that require the use of quite expensive NAD(P)H as a cofactor. For this reason, NAD(P)H recycling in the reaction is very important to reduce the cost. Dehydrogenases are valuable enzymes for such studies because they can regenerate these cofactors. One of these enzymes, NAD+- dependent formate dehydrogenase (FDH) (EC 1.2.1.2), oxidizes formate ion to carbon dioxide, while catalyzing the reduction of NAD+ to NADH. In this study, it is aimed to analyze the catalytic domain of NAD+ dependent mutant Candida methylica formate dehydrogenase by semi-rational design, one of the protein engineering methods. For this purpose, degenerative codon primers designed to perform iterative saturation mutagenesis for asparagine at position 119, which was assumed to be in the active region of the enzyme. Followed by the construction of a mutant library where 150 colonies were screened. Wild-type and mutant CmFDHs were expressed in E.Coli BL21 (DE3) cells in auto-induction Studier medium. The proteins were purified by using Ni-NTA HisTrap column and activity measurements of CmFDHs towards formate were carried out. Steady-state kinetic studies were performed against both formate and NAD+ where their Michaelis-Menten kinetic parameters were calculated. N119R, N119D, N119G and N119C mutations did not show any measurable activity towards formate. When compared to wild-type CmFDH, N119Y mutant CmFDH showed an increase in catalytic efficiency, while the N119H mutant CmFDH showed a significant decrease in catalytic efficiency. These results show that asparagine at position 119 is a functional amino acid for catalytic activity. Modeling studies are still in progress in understanding the interaction of encoded amino acids with the substrate in the selected position and the role of this position in the enzyme activity.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    610371

    Protein engineering applications on industrially important enzymes

    Endüstriyel öneme sahip enzimlerin protein mühendisliği uygulamaları

    GÜLŞAH ÖZGÜN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

  2. Tez No

    335801

    Site-directed mutagenesis applications on target sites of cmFDH to improve thermostability

    cmFDH enziminin termostabilitesinin geliştirilmesine yönelik hedef bölgeler üzerinde bölgeye özel mutasyon uygulamaları

    MERT TAHMAZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

    YRD. DOÇ. EMEL ORDU

  3. Tez No

    439698

    Increasing specific activity of NAD+-dependent Q105R mutant of candida methylica formate dehydrogenase

    NAD+-bağımlı mutant Q105R candida methylica fFormat dehidrogenazın spesifik aktivitesinin artırılması

    SONER TORUN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NEVİN GÜL-KARAGÜLER

  4. Tez No

    293881

    Protein engineering applications on candida methylica formate dehydrogenase to elucidate folding mechanisms and to increase the thermostability

    Protein mühendisliği ile candida methylica format dehidrogenaz enziminin katlanma mekanizmasının aydınlatılması ve termostabilitesinin arttırılması

    EMEL ORDU

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

  5. Tez No

    492610

    NAD+ bağımlı Candida methylica format dehidrogenaz enziminin R258 ve H311 pozisyonlarının reaksiyon mekanizmasındaki rollerinin incelenmesi

    Investigation of the role of R258 ve H311 positions of NAD+ dependent Candida methylica formate dehydrogenase on the reaction mechanism

    MELTEM ÇORBACIOĞLU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    BiyokimyaGebze Teknik Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. BARIŞ BİNAY

Geri Dön