Establishment of cell lines with inducible expression of shRNA for an estrogen responsive gene
Östrojen duyarlı bir genin indüklenebilir shRNA ifadesi olan hücre hatlarının oluşturulması
- Tez No: 507672
- Danışmanlar: PROF. DR. MESUT MUYAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2018
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 117
Özet
Östrojen hormonları, başta 17β-östradiol (E2), dolaşımdaki başlıca östrojen olarak, östrojen reseptör α (ERα)'nın E2 sinyal yolağıyla üreme organları ve meme bezleri dahil çeşitli doku/organların homeodinamik düzenlemesinde yer alır. E2'nin ERα'ya bağlanması, östrojen duyarlı gen ifadelerini düzenlemek için reseptörü aktive eder. Önceden laboratuvarımızda yürütülmüş olan mikrodizi ve gen ekspresyonu çalışmaları, CXXC5'in ERα tarafından düzenlenen östrojen duyarlı bir gen olduğu gösterilmiştir. Devam eden çalışmalarımız ise çinko-parmak CXXC ailesinin bir üyesi olarak, CXXC5'in; metil olmayan CpG dinükleotidlere bağlandığını göstermektedir. İfade güçlendirici ve aktifleştirici bölgelerde bulunan CpG adalarının metilasyonunun, genlerin susturulmasına neden olduğu düşünülmektedir. Bu aile proteinlerinin metillenmemiş CpG'lere bağlanmasının, DNA metilasyonunu önleyerek transkripsiyonda rol oynadığı düşünülmektedir. CXXC5 ile ilgili çalışmaların sınırlı olmasına rağmen, CXXC5'in hücresel olaylara, transkripsiyon faktörü, ko-regülatör ve/veya epigenetik faktör olarak katıldığı düşünülmektedir. E2 aracılığıyla gerçekleşen hücresel olaylarda CXXC5'in rolünü ele almak için; 1) protein partnerlerini tanımlamayı ve 2) CXXC5'in hücresel işlevini tanımlamayı amaçladık. Proteinler hücresel bağlamdaki görevlerini, proteinlerle uzay-zamansal bir düzlemde etkileşerek gerçekleştirdiğinden, ilk olarak olası CXXC5 protein partnerlerinin tanımlanması için maya-iki-melez (Y2H) hizmetini ve sonrasında doğrulama için memeli-iki-melez sistemi kullanmaya karar verdik. Ancak, Y2H ile tanımlanan partnerlerin hiçbirini M2H ile CXXC5 ile etkileşen bir protein partneri olarak doğrulayamadık. Bu sonuçlara dayanarak, etkileşen proteinlerin biyotin etiketlenmesiyle işaretlenerek tanımlanmasını sağlayan BioID yaklaşımını kullanmaya karar verdik. Devam eden çalışmalarımız, CXXC5 protein partnerlerinin tanımlanması için BioID'nin kullanılabileceğini göstermektedir. E2 aracılığıyla gerçekleşen hücresel olaylarda CXXC5'in görevini ele almak için Y2H'ye paralel olarak yaptığımız çalışmalarda, CXXC5'in ifadesinin arttırıldığı veya susturulduğu hücre hatları üretmek istedik. Ancak hücresel ölüm nedeniyle; hücre hatlarının üretiminde başarısız olduk. Başarısızlığımız, CXXC5 üzerinde fonksiyonel çalışmalar yapmamızı sağlayabilecek hücre hatlarını oluşturmak için tetiklenebilir bir ifade sisteminin kullanılmasını gerektirdi. Sistemin, CXXC5 ifadesi için açma / kapatma anahtarı içeren sürdürülebilir hücre hatları sağlaması bekleniyordu. Bunun için, hedef genin tetrasiklin (Tet) uyarılabilir ifadesini sağlayan pINDUCER sistemini kullandık. Bu amaçla, başlangıçta CXXC5 sentezini susturabilmek için shRNA yaklaşımı kullandık. Her ne kadar monoklon üretimini başarmış olsak da, CXXC5 sentezini azaltamadık. İfadesi arttırılmış veya susturulmuş CXXC5 elde etmek için çalışmalara farklı hücre hatları ve ekspresyon sistemleri ile devam edilmektedir.
Özet (Çeviri)
Estrogen hormones, primarily 17β-estradiol (E2) as the primary circulating estrogen, are involved in the homeodynamic regulation of various tissues/organs including mammary gland within which estrogen receptor α (ERα) conveys E2 signaling. The binding of E2 to ERα activates the receptor to regulate estrogen responsive gene expressions. Previous microarray and gene expression studies of our laboratory indicate that CXXC5 is an estrogen responsive gene regulated by ERα. Our ongoing studies also indicate that CXXC5 as a member of zinc-finger CXXC domain protein family, binds to non-methylated CpG dinucleotides. Methylation of CpG islands found in enhancer and promoter regions is thought to silence gene transcriptions. Binding of this family proteins to non-methylated CpGs is suggested to have a role in transcription by preventing DNA methylation. Although studies on CXXC5 are limited, CXXC5 appears to participate in cellular processes as a transcription factor, co-regulator and/or epigenetic factor. To address the role of CXXC5 in E2-mediated cellular events, we aimed 1) to identify protein partners and 2) to define cellular function of CXXC5. Since, proteins perform their functions within the context of interacting proteins in a spacio-temporal manner, we initially decided to use a yeast-two-hybrid (Y2H) service for the identification of putative CXXC5 protein partners followed by a mammalian-two-hybrid system (M2H) for verification. However, of the reported interacting partners identified with Y2H, we were not able to verify any protein as the CXXC5 interacting partner with M2H. Based on these results, we decided to use the BioID approach that allows the identification of interacting proteins through the biotin tagging of interactors. Our ongoing studies suggest that BioID can indeed be used for the identification of CXXC5 interactors. In studies we performed in parallel to Y2H to address the role of CXXC5 in E2-mediated cellular events, we wanted to generate cell lines in which CXXC5 was stably overexpressed or silenced. However, due to cellular death; we failed to generate stable cell lines. Our failure necessitated the use of an inducible expression system to generate cell lines that allow us to conduct functional studies on CXXC5. The system was expected to provide us maintainable cell lines containing on/off switch for CXXC5 expression. For this, we used pINDUCER system, which provides a tetracycline (Tet) inducible expression of target gene. For this purpose, we initially used an shRNA approach to specifically down-regulate CXXC5 synthesis. Although we have succeeded the generation of monoclones, we could not decrease CXXC5 synthesis. Studies for obtaining overexpressed or silenced CXXC5 has been continuing with different cell lines and expression systems.
Benzer Tezler
- Enerji ihtiyacının karşılanmasında doğalgaz ve rüzgâr kaynaklı enerji çevrim santralleri; yatımlar üzerine stratejik bir analiz
Natural gas and wind based cycle plant in supplying the needs of energy reguirement; a strategic analysis on investments
GÜVEN KARAMAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2015
İşletmeOrdu ÜniversitesiYenilenebilir Enerji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. KADİR AKSAY
- İşletmelerde finansal başarısızlık tahminlemesi ve Borsa İstanbul'da faaliyet gösteren gıda şirketlerinde uygulama
Financial distress forecasting in businesses and application in food companies operating in stock exchange Istanbul
KEREM URAL
- Orta doğu'da yeni stratejik çevreleme girişimlerinin Türk dış politikasına etkisi: Suriye örneği
The effects of strategic containment attempts in the middle east on turkish foreign policy: The example of Syria
OĞUZHAN ERGÜN
Doktora
Türkçe
2013
Kamu YönetimiDokuz Eylül ÜniversitesiKamu Yönetimi Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. AHMET NAZMİ ÜSTE
- İslâm'ın ik yıllarında (h.1-41/m.622-661) iskân
Settlement in early years of islam (ah.1-41/a.c.622-661)
TAHSİN KOÇYİĞİT
Doktora
Türkçe
2006
TarihDokuz Eylül Üniversitesiİslam Tarihi ve Sanatları Ana Bilim Dalı
PROF. DR. RIZA SAVAŞ
- Müslüman Kardeşler'in iktidar tecrübesi: Mısır örneği
Governing experience of the The Muslim Brotherhood: Egyptian example
CEMAL KAZAK
Yüksek Lisans
Türkçe
2015
Siyasal BilimlerSakarya ÜniversitesiOrtadoğu Araştırmaları Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MUHAMMED MÜCAHİD DÜNDAR