Concentration and detection of bacteria with combined AC electrokinetic and impedance analysis in microfludic systems
Mikroakışkanlarda AC elektrokinetik tekniklerle empedans tabanlı bakteri algılaması
- Tez No: 510574
- Danışmanlar: DOÇ. DR. HÜSEYİN KIZIL
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Bilim ve Teknoloji, Mühendislik Bilimleri, Science and Technology, Engineering Sciences
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2018
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Nanobilim ve Nanomühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Nanoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 67
Özet
Mikroakışkan sistemler patojen algılamada hızlı ve doğru sonuç alma yönünden maliyeti düşük, yeni ve gelişen bir teknolojidir. Elektrokinetik tekniklerin empedans analizi ile birlikte bakteri tespiti mikroelektromekanik sistemlerdeki yeni gelişmelerle birlikte etkili bir yöntemdir. Bakterilerin, virüslerin ve kanser hücreleri ve benzerlerinin mikrokanallarda elektrokinetik kuvvet ile hücrelere döndürme, hücreleri elektrik alanından uzaklaştırma yada elektrik alanına yakınlaşırma gibi mekanik bir bileşen olmadan yönlendirilmelerin yapılması mümkündür. Bakteri kaynaklı hastalıklar dünya genelinde çok yaygın olup tespiti maliyetlidir. Tespit zamanı ve düşük sayıda algılanması geliştrilmesi gereken önemli parametrelerdir. Mikro teknolojideki gelişmeler elektriksel kuvvetin makro ölçülerden mikro ölçülere uygulanmasını mümkün kılmıştır. Elektrokinetik kuvvetler empedans analizi ile birlikte bakteri hücrelerinin ayrıştırılması, konsantrasyonu ve algılanmasında etkili ve efektif bir yöntem olup kanda, gıdada ve suda erken tespiti kritiktir. Bakteri konsantrasyonun arttırılması algılamada hassasiyetin arttırılması için önemli bir adımdır. Herhangi bir ajan kullanılmadan oluşturulan bu sistemlerde kullanılan geometrik yapılar elektriksel alanının etkili bir şekilde kullanma yönünden önemli bir unsurdur. Bu aşamada bir çok geometrik model nümerik ve deneysel olarak denenmiş optimum model bulunmaya çalışılmıştır. Dielektroforetik ve elektroforetik kuvvetler biyoparçacıkların manipulasyonunda etkili elektrokinetik tekniklerdir. Bu çalışmada E.coli NCTC(13167 ), Enterobacter aerogenes bakterileri kullanılmıştır. Bakterilerin elektriksel alana tepkisi, bakterilen büyüklüğüne, şekline, hücre ve sıvının iletkenlik ve geçirgenliğine ve uygulanan frekansın büyüklüğüne bağlıdır. Bakterilerin dilektroforetik kuvvetere karşı tepkisi birbirinden farklı olacağı için, dielektoforetik kuvvetler hücrenin diğer hücrelerden ayrıştırılmasına, belli bir bölgede hapsetme veya algılama gibi bir çok amaç için kullanılmaktadır. Dielektroforetik kuvvet, hücreler çevresini saran sıvıdan daha fazla polarize olma durumunda göre daha yoğun olan elektriksel kuvvete doğru çekilirler ve bu kuvvet pozitif dielektoforetik kuvvet olarak adlanıdırlır. Hücrelerin daha az polarize olma durumunda zayıf elektriksel alana doğru itilir ve negatif dilektroforetik kuvvet olarak adlandırılır. Mikroakışkan kanallarda p-Dep in etkisi elektriksel alanın daha yüksek olduğu elektrot kenarlarında gözlenir. Bakteriler kanalın orta bölgesinde konumlandırılır ve hidrodinamik kuvvetin etkisiyle algılama bölgesine sürüklenir. Algılama bölgesinde uygulanan 1 kHz ile 500 Khz aralığında bakteri konstantrasyonuyla değişen empedans değişimleri ile bakteri algılaması yapılır. Akış hızı empedansı değiştiren diğer bir etmendir. Daha hızlı akan bir akışta daha büyük empedans değişimleri elde edilir. Yüksek frekanslarda ölçülen empedans cevabı büyük oranda sistemin direnç özelliğinden kaynaklanır bakterilerin etkisi görülmez. Bakterilerin etkisinin görülebilmesi için düşük frekanslar uygulanmalıdır. Düşük frekanslarda bakteriler daha çok polarize eğilimini gösterirler. Bakteri hücreleri prokoryatik hücreler olup duvar yapılarındaki farklılıklardan dolayı gram negatif ve gram pozitif bakteri olarak ikiye ayrılırlar. Genel olarak her iki bakteri türünde sitoplazmayı çevreleyen yalıtkan sitoplazmik zar ve iletken olan ince hücre duvarı tabakası bulunmaktadır. Gram negatif bakterilerde hücre duvarı dış bir zar ve periplazmik aralıktan oluşmuştur. Periplasmik aralıkta bulunan peptidoglikan tabakası gram negatif bakterilerde ince iken gram pozitif bakterilerde daha kalın olup bu tabaka bakterilen en iletken tabakasıdır. Bakterilere uygulanan elektriksel kuvvet düşük empedans bölgesi (hücre duvarı) yüksek empedans bölgesi (sitoplazmik zar, dış zar) arasında değişir. Bakterilerde bulunan iki yüksek empedans bölgesinden olan hücre duvarını çevreleyen çift fosfolipit tabakasından oluşan dış zar sadece gram negatif bakterilerde bulunmaktadır. Bu yağ tabakasından dolayı uygulanan düşük frekanslar bu tabakayı geçememektedir. Öte yandan yüksek frekanslarda ise elde edilen empedans değerleri ise bakteri konstrasyonundan bağımsız olup sistemin direnç değerlerini göstermektedir. Her bakterinin karakterisitik elektriksel özelliği bulunmaktadır ve bu özellik empedans analizi ile bakterileri algılamada kullanılabilir. Bakteriler arasındaki bu farklı elektriksel özellikler sistemin karmaşıklığını ve maliyetini arttıracak olan herhangi bir antikor kullanılmadan bakterileri algılama ve tanımlamada kullanılabilir. Bu elektriksel sinyalin güçlendirilmesinde kullanılan mikroakışkan kanallardaki geometik yapılar ve CNT gibi malzemelerin kullanılması algılama limitini yükseltecektir. Üretilen sensör konsantasyon ve algılama bölgesi olmak üzere iki bölümden oluşmaktadır. Dielektroforetik kuvvet kullanılarak bakteri konsantrasyonu için birbirine geçmiş tarak şeklindeki paralel elektrotlar, 45° C eğimli paralel elektrotlar, asimetrik elektrotlar ve balık sırtı şeklinde elektrolar üretilmiştir. Üretilen bu elektrotların genişliği 15 mikron, aralarında uzaklıklık da 10 mikron olacak şekilde tasarlanmıştır. Söz konusu tasarımlar comsol multipysic 5.2 yazılımı kullanılarak her bir tasarım için dielektroforetik kuvvetleri simüle edilmiştir. Konsantre edilmiş bakterilerin ikinci bölgede empedans analizi ile algılamasını yapacak birbirine geçmiş tarak şeklindeki paralel elektrotlar üretilmiştir. Sensörün üretiminde öncelikle cam atlıkları temizlemek için KOH çözeltisi kullanılarak, camlar 10 dakika boyunca ultrasonik banyo cihazında bekletip saf su ile banyo edildikten sonra, aseton çözeltisinde 10 dakika boyunca bekletilmiş sırasıyla alkol ve saf su ile banyo edilip kurutulmuştur. Temizlenen camlar spin kaplama cihazı ile AZ9260 fotoresist kullanılarak 5 mikron yüksekliğinde fotoresist ile kaplandı. Farklı geometrilerde üretilen maske kullanılarak istenen tasarım litografi tekniği ile cam altlıklar üzerine aktarıldı sonrasında fiziksel buhar yöntemi ile 200 nm yüksekliğinde Titanyum katmanı oluşturulup aseton solüsyonunda çözdürülüp istenilen tasarımlar cam altlıklarda oluşturulmuştur. Bakterilerin akışı için 25 mikron yüksekliğinde mikrokanallar pdms malzemesi kullanılarak oluşturuldu. Pdms 10:1 oranında katılaşıtırıcısı ile birlikte kullanılarak, kabarcıkları vakum ortamında alınmış ve 90⁰ C de 20 dakika boyunca hot plate cihazında bekletilmiştir. Elde edilen pdms, kanal tasarımının bulunduğu 25 mikron yüksekliğinde SU-8 kaplı altlık üzerine dökülüp kanal tasarımı ve yüksekliği pdms tabakasına aktarılmıştır. Pdms tabakası ve titanyum biriktirilmiş cam altlık plazma bonding yöntemi ile birleştirişmiş, 45°C de hot plate üzerinde 10 dakika bekletilmiştir. İki bakteri içinde aynı konsantrede farklı miktarlarda empedans ölçümleri alındı. Sırasıyla 500, 1000, 5000, 20000 cfu/ml konsantrelerinde aynı sıvıda zamana bağlı ve frekansa bağlı empedans ölçümleri alındı. Empadans analizinde dielektroforetik kuvvetin etkisini görmek için 3.2 mikron büyüklüğündeki polyestren partikülleri ile 0.00025 S/m iletkenliğindeki distile su kullanıldı. Konsantrasyon bölgesindeki elektrotlara dep uygulayarak ve uygulamayarak alınan sonuçlarda dep uygulanan deneylerde daha büyük empedans değişimi görüldü. Dilektororetik kuvvet sensör hassasiyetini arttıran önemli bir etmendir. Distile suda p-dep 100 Hz-5 Mhz arası frekans aralığında görüldü. Tespit edilmesi istenen sıvının iletkenliğine göre gerekli frekans ayarlanark hem p-dep hem de n-dep ile konstrasyon yapmak mümkündür. P-dep te partiküller elektrot kenarlarında odaklanırken n-dep ile elektrot merkezinde odaklanırlar. Algılama bölgesinde uygulanan frekans arrtıkça empedanstaki değişim azalmaktadır, yaklaşık 100 kHz den sonra uygulanan deneylerde empedans cevapı tamamıyle dirence bağlı olarak değişmekte ve bu bölgedeki bakteri sayısından bağımsız hale gelmektedir. E.coli ve Enterobacter Aerogenes ile yapılan deneyler sonucu sensörün algılama limiti 500 cfu/ml konsantrasyonudur
Özet (Çeviri)
Microfluidic systems for pathogen detection is a enabling and emerging technology since it is cost affective, fast response and accurate results are obtained. Conventional bacteria detection tecniques are time consuming, labour, expensive and also require more sample that increase contamination risk. Electrokinetic tecniques combined with impedance analysis is an effectice way to detect bacteria with the advancement in micromachinig technology which leads new insight into microfluidic systems. Manipulation of bacteria cells, viruses, cancerous cell etc. under ac electrokinetic field provide a micro/nano hand in microfluidic channel via translational movement, attracting or reppelling behaviour in channels to electric field. Bacteria related diseases is a common and costly public health problem around the world. Detection time and detection at low concentration level of bacteria are important parameters to study to improve. Impedance analysis combined with electrokinetic forces are effective method and important analytical tool for detection, concentration, seperation and trapping of bacteria cell. Rapid and early detection of bacteria is crtical in blood, food, water for diagnostic and control purposes. Concentration and focusing bacteria at same chip are performed by ac electrokinetic tecniques and detected by impedance analysis. Concentrating bacteria is an critical step in order to enhance sensitivity of detection limit to be able to sense the existance of bacteria population. For label free detection geometrical architecture of system is important for detection limit in term of use electric field effectively. At this point a variety of geometrically confine region are created to find better design. The role of focusing region is faciliate to concentrate bacteria to by transporting to spesific region which is called detection region. The contribution of focusing region is shown experimentally. Dielectrophoretic and electroosmotic forces are useful electrokinetic ways to manipulate bioparticle cells. p-DEP forces are used to focus and concentrate bacteria at focusing region while impedenace spectrometry is performed at detection region to analyse detection of bacteria with Electrochemical impedance analyser. E.coli NCTC (13167 ) and Enterobacter aerogenes bacteria cells are used in this study. The response of bacteria cells to external electric field depend on their size, shape, internal structure, electrical conducitivity and permittivity. Since each bacteria has charecteristic electrical properties, their response to dielectrophoretic forces will be different for same frequency and in same medium. This different response can be used for seperation of different type bacteria as well as can be used discriminate bacteria based on different dielectric properties with analysing impedance spectroscopy. Every bacteria has characterisitc electrical properties that will be useful for detection with help of impedance analysis. These difference electrical properties of bacteria may use to identify them without using any antibody which incerase complexity of system and the cost. To enhance the electrical signal some optimization of geometrical structure ofelectrodes and microfludic channel is employed to increase detection limit. In microfluidic channel the effect of p-Dep are seen on the edge of electrodes where the electric field intensity is relatively high than the centre of electrode. Once bacteria cells are gathered at middle of channel, they are drived to detection region by hydrodynamic drag forces since inertial forces are insigficant at such low dimension. At detection region concentrated bacteria is analysed with change in impedance. The flow rate is another factor that change electrical impedance the more flow rate the more larger change in impedance response is obtained. At high frequency impedance response that are measured at detection region dominated resistivity of solution. In another saying the effect of bacteria cell is insgificant. In order to observe electrical property of bacteria low frequency is applied since most bacteria are polarizable in electric field and at low frequency bacetria cells tend more polarizable than fluid in microfluidic channel. Bacteria is a prokaryotic cell which has a conducting cell wall and insulating plasma membrane surround the cytoplasma and divided to gram negative and gram positive bacteria according to difference in the cell walls. Cell wall cover the insulating cytoplasmic membrane. Cell wall in gram negative bacteria consist of outer membrane and periplasmic space. Periplasmic space include a thin peptidoglycan layer which is main component of cell wall. AC electric field that apply bacteria cell alternate between low impedance region (cell wall) and high impedance region (lipid membranes). Bacteria cell has main two high impedance lipid regions are outer membrane in cell wall which existed only in negative gram bacteria and inner membrane (cytoplasmic, plasmic membrane). Altough these two structure are consist of double layer phospholipid layers outer membrane has lipopolysaccharide component which carry negative charges and responsible for negative charge and hydrophilic surfaces which make its permittivity greater than inner membrane's. For each bacteria same amount of cells are conducted and the impedance responses are compared. Approximately 500 cfu/ml, 1000 cfu/ml, 5000 cfu/ml, 20000 cfu/ml are conducted for each bacteria at same medium for time and frequency dependent measurements. In order to see the contrubition of dielectrophoretic force 3.2 µm size polystyrene particles are conducted in 0.00025 S/m distile water. At this point expreiments performed with dep and without dep. In the medium of distile water p-dep is observed at the range of between 100 Hz-5 Mhz ferquency at focusing region. Results indicate that the impedance decreases with dep forces which increase sensitivity of impedance based biosensor. Another parameters that increase sentivity is narrow detection electrodes and decrease channel height. Particles concentrated at the edge of electrodes at p-dep while at n-dep concentrated on the center of electrode than drive to detection region for impredance analysis. The impedance change at detection region decreases with increasing frequency applied. Results show that after approximately 100 kHz the impedance response is purely resistive and independent of number of bacteria. The detection limit for E.coli bacteria and Enterobacter aerogenes is determined as 500 cfu/ml.
Benzer Tezler
- Gram-positive bacteria sensing in a microfluidic chip by ac electrophoresis
Ac elektroforez ile mikroakışkan sistemlerde gram-pozitif bakteri algılaması
MERVE YALÇIN
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
Bilim ve Teknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiNanobilim ve Nanomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HÜSEYİN KIZIL
- Klebsiella pneumoniae suşlarında karbapenem direncinin fenotipik ve genotipik yöntemler ile araştırılması
Detection of the carbapenem resistance of klebsiella pneumoniae with genotypic and fenotypic methods
MEHMET AKİF DURMUŞ
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2017
Mikrobiyolojiİstanbul ÜniversitesiTıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MUSTAFA DERYA AYDIN
- Enerji, optik sensör ve aktif gıda paketleme alanlarında kullanılmak üzere yüzeyi işlevselleştirilmiş floresans karbon noktaların geliştirilmesi
Development of surface functionalized fluorescence carbon dots for use in energy, optical sensor, and active food packaging areas
MELİS ÖZGE ALAŞ
Doktora
Türkçe
2022
Kimya MühendisliğiMersin ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. RÜKAN GENÇ ALTÜRK
- Gıda patojenleri için dijital PCR ile hızlı tespit yöntemlerinin geliştirilmesi
Development of rapid detection methods for food pathogens using digital PCR
YELİZ YÜCEL ÖZ
Doktora
Türkçe
2023
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYTEN KARATAŞ