Geri Dön

Controlling bacterial biofilms by applying extremely low frequency electromagnetic fields (ELF-EMFS)

Çok düşük frekanslı elektromanyetik alan (CDF-EMA) uygulanarak bakteriyel biyofilmlerin kontrolü

PDF İndir

  1. Tez No: 539989
  2. Yazar: HASAN KAHRAMAN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. MELEK TÜTER, DR. ÖĞR. ÜYESİ TURHAN KARAGÜLER
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2018
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 112

Özet

Bakteriler genellikle birbirinden bağımsız olarak düşünülüp planktonik formda incelenirler. Fakat birçok araştırma göstermiştir ki bakteriler biyofilm olarak adlandırılan topluluklar halinde birbirleriyle etkileşerek çoğalmaktadırlar. Biyofilm oluşumu hem canlı hem cansız sistemler üzerinde kendiliğinden ortaya çıkabilen ve bakterilerin hayatta kalmalarını sağlayan önemli bir mekanizmadır. Bu durum bakterilerin simbiyotik olarak besinlere ulaşma ve hayatta kalma şansını büyük oranda arttırmaktadır. Biyofilmler, ürettikleri ekzopolimer matriks içerisinde yaşamaları ile karakterize edilen, mikrokoloniler oluşturarak yüzeye yapışan bakteri gruplarıdır. Matriksi oluşturan hücre dışı polimerik yapılar ağırlıklı olarak polimerik şekerlerden meydana gelmekle birlikte, proteinler, nükleik asitler ve lipidler de bu polimerik yapıların içeriğini oluşturmaktadır. Matriks yapısını oluşturan biyopolimerler nedeniyle, biyofilmi oluşturan bakteriler, daha değişken metabolik yol izlerine sahip ve geleneksel antimikrobiyal ajanlara karşı dirençlidirler. Biyofilm enfeksiyonları dünyada birçok ölüme yol açmakta ve yüksek sağlık harcamalarına sebep olmaktadır. İnsan vücudunda biyofilm oluşumuna yol açan başlıca etkenler arasında medikal cihazların kullanımı ve implantlar gelmektedir. Biyofilm yapılar normal hücre yapılarıyla karşılaştırıldıklarında makrofaj ve antibiyotiklere karşı daha dirençli oldukları için oluşumlarını engellemek oldukça güçtür. Bu çalışmada, tıbbi cihazlar ve implantlar üzerinde biyofilm oluşturarak enfeksiyona yol açtığı bilinen Staphylococcus epidermidis (Gram +) ve Pseudomonas aeruginosa (Gram -) bakterilerinin, çok düşük frekanslı elektromanyetik alan (ÇDF-EMA) uygulanması sonucunda biyofilm oluşturmalarının yavaşlatılması veya engellenmesi amaçlanmıştır. Bu patojenler özellikle bağışıklık sistemini hedef alarak ve zayıflatarak enfeksiyona yol açmaktadır. S. epidermidis ve P. aeruginosa' nın türe özgü bazı genlerinin biyofilm gelişimini etkilediği bilinmektedir. Bu genlerden S. epidermidis'e ait atlE geni ve P. aeruginosa'ya ait rpoS geninin bakteriler arası iletişim (quorum-sensing) mekanizmasında görev aldığı ve biyofilm oluşumundan sorumlu oldukları rapor edilmiştir. Bu kapsamda, ÇDF-EMA'ya maruz bırakılan bakterilerin özellikle atlE ve rpoS genlerinde mutasyonların meydana gelip gelmediği incelenerek biyofilm oluşumunda sorumlu genlerin nasıl etkilendiği araştırılmıştır. P. aeruginosa gram (-), katalaz-pozitif ve aerobik çubuk şekilli bir patojen bakteridir. Hücre-yüzey polisakkaritleri bakterinin hayat döngüsünde önemli rol oynar. Bu polisakkaritler hücre duvarı ve çevre arasında bariyer görevi görerek, konak-patojen etkileşimlerine aracılık eder ve biyofilm oluşumuna yol açan yapısal bileşenleri oluştururlar. Diğer yandan, S. epidermidis gram (+), koagülaz-negatif ve katalaz-pozitif özellikte olan streptokoklardan bir bakteri türüdür. Birden fazla tabaka oluşturma özelliğine sahip olması nedeniyle, yapay yüzeylerde kolaylıkla biyofilmler oluşturabilmektedir. Biyofilm oluşturan patojenleri uzaklaştırmada literatürde çeşitli yöntemler uygulanmaktadır. Medikal cihazlara bağlı enfeksiyonları engellemede kullanılan başlıca stratejilerden birisi standart antimikrobiyal ajanların kullanıldığı sistemik terapilerdir. Ancak implantlar üzerindeki enfeksiyonları engellemek oldukça güçtür. Çünkü biyofilmler yapıları gereği antibiyotiklere karşı direnç göstermektedir ve başarılı bir terapi için medikal cihazın çıkarılması gerekmektedir. Biyofilm enfeksiyonları ile mücadelede kullanılan bir diğer yöntem, bakterilerin yapışmasını engelleyen fonksiyonel yüzeylerin oluşturulmasına yöneliktir. Geçmiş dönemlerde koruyucu kaplamaların yapısında toksik maddeler yaygın olarak kullanılmaktaydı. Ancak günümüzde çevresel etkileri göz önüne alındığında kullanımlarının azaldığı söylenebilir. Bu azalmada bazı maddelerin yasaklanması da ayrıca önemli etken olmuştur. Yoğun olarak devam eden bir başka yaklaşımda ise bakterilerin iletişim mekanizmasını (quorum-sensing) bozarak biyofilm oluşumunun engellenmesi amaçlanmıştır. Quorum-sensing mekanizması kullanılarak doğal yapılarda sentetik analoglar vasıtasıyla başarılı sonuçlar elde edilse de, oluşan toksinlerden dolayı klinik aşamaya geçilememiştir. Ayrıca quorum-sensing yöntemlerinde sadece belirli patojenler hedef alınabilmektedir. Birçok in vitro çalışmada, fajların da biyofilm oluşturan hücreleri enfekte ettiği görülmüştür. Fajlar, biyofilmlerin ekzopolimerik matriksine ait yapıları parçalayarak iç tabakalara nüfuz edebilir ve biyofilm oluşumunu engelleyebilir. Fajların klinik olarak kullanılabilmesi için bir şekilde implantlara entegre edilmesi gerekmektedir. Ancak bu yöntemde fajların bakteriyel hücreleri enfekte ettiğinin ve biyofilm üzerindeki polisakkaritleri parçalayabildiğinin belirlenmesi gerekmektedir. Elektromanyetik alanlar'ın (EMA) hücre davranışları üzerinde herhangi bir etkisinin olup olmadığı uzun süredir araştırılmaktadır. EMA'nın etkileri üzerine çeşitli hayvan modelleri (in vivo) ve hücre kültürleri (in vitro) üzerinde çalışmalar yürütülmüş olup etkileri üzerine kesin bir yargıya varılamamıştır. Ancak çeşitli biyokimyasal çalışmalarda birçok enzimin yapı ve fonksiyonlarının, ayrıca bazı hücre organellerinin yapı ve fonksiyonlarının radyofrekans dalgalarına bağlı olarak bozulduğu yaygın olarak kabul edilmektedir. Günümüzde uygulanan yöntemler göz önüne alındığında biyofilme bağlı enfeksiyonları engellemek ve kontrolünü sağlamak için alternatif yöntemler geliştirmeye acil ihtiyaç vardır. Elektromanyetik alan uygulayarak yapılan birçok deneysel çalışmada belirli frekanslardaki elektromanyetik alanların biyofilm oluşumlarını etkilediği görülmüştür. Biyofilm oluşumunu engellemeye yönelik geleneksel yöntemlerin problemleri göz önüne alındığında elekromanyetik alan yöntemi ile biyofilm oluşumunun engellenmesi alternatif bir yol olabilir. Çalışmanın özgünlük noktasını biyofilmlerin üretimi ve uzaklaştırılmasının aynı yerde ve aynı ortamda gerçekleştirildiği göz önüne alınarak, P. aeruginosa ve S. epidermidis bakterileri ÇDF-EMA'ya maruz bırakılarak test edilmiştir. Üç aşamada gerçekleşen bu çalışmada: i) iki farklı model mikroorganizmadan (P. aeruginosa ve S. epidermidis) kontrollü olarak biyofilm eldesi; ii) biyofilmlerin ÇDF-EMA'ya maruz bırakılarak uzaklaştırılması ve/veya tamamen ortadan kaldırılması ve iii) ÇDF-EMA'ya maruz bırakılan S. epidermidis ve P. aeruginosa'ya özgü atlE ve rpoS genlerine dizileme yapılarak gen düzeyinde meydana gelen değişiklikler incelenmiştir. Abiyotik bir yüzeye mikrobik bağlanmayı incelemek için, çoğunlukla 96-kuyucuklu plaka deneyi olarak da adlandırılan ve yüksek verimli bir yöntem olan mikrotitre plakası biyofilm testi kullanılır. Bu yöntemde, hücreler mikrotitre plakalarda istenilen süre kadar büyütülür ve daha sonra planktonik bakterileri uzaklaştırmak için kuyular yıkanır. Daha sonra kuyulara yapışan hücreler, bağlanma oranının görselleştirilmesini sağlayan bir boya ile boyanır. Bu yüzey-bağımlı boya, oluşan biyofilmin yarı-kantitatif oranını belirlemek için çözünür hale getirilir. ÇDF-EMA'ları oluşturmak için bir deney düzeneği tasarlanmıştır. Tasarlanan deney düzeneğinin iç ve dış çapı 160-170 mm, uzunluğu 440 mm ve 180 sarımlı bakır telden oluşan bir Solenoiddir. Cihazın, 45-300 Hz frekans aralığında ve 0.1 ile 1.0 mT ±%2 yoğunlukları arasında değişen, merkez hat boyunca düzenlenen ve tanımlanan homojen, sinüs dalgası değişimli manyetik alanlar vermesi beklenmektedir. Solenoid, ayarlanmış bir frekans ve gerilimle sinüs dalgası çıkışı oluşturabilen bir güç kaynağına bağlıdır. Deney düzeneği, elektromanyetik alanın maksimum homojenliğinin elde edildiği varsayılan silindir yapıdaki Solenoidin merkezine biyofilmlerin büyümesi için yerleştirilen polistiren ve polipropilen mikrotitre plakalarından oluşmaktadır. Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus epidermidis biyofilm oluşumunu araştırmak için, her suş polistiren ve polipropilen yapıdaki iki farklı yuvarlak tabanlı 96-kuyucuklu mikrotitre plakalara inoküle edilmiştir. P. aeruginosa ve S. epidermidis oluşumlarının herbiri için Solenoid içinde ÇDF-EMA'ya maruz bırakılan ve maruz bırakılmayan kontroller olmak üzere, birer örneği oda sıcaklığında inkübe edilmiş ve 24 saat ile 48 saat zaman aralıklarında analiz edilmiştir. 45 Hz, 50 Hz, 100 Hz, 200 Hz ve 300 Hz frekanslarında 1 mT yoğunluğa maruz bırakılan P. aeruginosa ve S. epidermidis'in, polistiren ve polipropilen yüzeylerinde biyofilm oluşumları incelenmiştir. ÇDF-EMA'nın rpoS ve atlE genleri üzerindeki etkisini araştırmak için, ÇDF-EMA'ya maruz bırakılan bakterilerin genomik DNA'sı izole edilmiş ve daha sonra biofilm gelişiminden sorumlu olan rpoS ve atlE genleri dizilenip herhangi bir DNA mutasyonu olup olmadığı incelenmiştir. DNA dizilemesi için genomik DNA izolasyonu, ileri ve geri primer tasarımı, Polimer Zincir Reaksiyonu (PZR), agaroz jel elektroforezi ve DNA dizilimi gibi standart prosedürler takip edilmiştir. DNA dizi analizi için ÇDF-EMA'ya maruz bırakılan kültürler ve maruz bırakılmayan kontrol grubu kullanılmıştır. Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus epidermidis'in 45 Hz ve 50 Hz'de 1.0 mT'ye maruz kalması sonucu hücre canlılığının azaldığı ve biyofilm oluşumunun 48 saat sonra hem polistiren hem de polipropilen yüzeyler üzerinde %40 oranında önlendiği gözlemlenmiştir. Bunun yanında 100 Hz, 200 Hz ve 300 Hz frekanslarında ve 1 mT yoğunluğunda polistiren ve polipropilen yüzeylerde ÇDF-EMA'ya maruz bırakılan bakterilerin biyofilmler oluşturması açısından anlamlı bir fark gözlemlenmemiştir. ÇDF-EMA (1mT 50 Hz) etkisinin, 48 saat boyunca 3 saatlik zaman aralıklarında nicel olarak incelenmesi sonucunda, S. epidermidis biyofilminin 24 saat sonra ÇDF-EMA etkisiyle azaldığı görülmüştür. ÇDF-EMA'nın planktonik P. aeruginosa üzerinde önemli bir etkisi olmadığı görülmüştür. RpoS ve atlE genlerinin analizi sonucunda, biyofilm oluşumu sırasında maruz kalan ve maruz kalmayan kontrol örneklerinden elde edilen rpoS ve atlE genlerinin DNA dizisi fragmanlarında farklılıklar gözlenmemiştir.

Özet (Çeviri)

Bacteria are often studied as individual organisms in planktonic form. However, many applications have shown that they grow in communities known as biofilms which work symbiotically to enhance their ability to survive and obtain nutrients. Bacteria produce exopolymeric matrix which enhance them to attach and form microcolonies on surfaces. Extracellular polymeric structures which form the matrix are mainly composed of polymeric sugars, proteins, nucleic acids and lipids. Due to their structural differences and metabolic pathways, biofilm bacteria are extremely resistant to conventional antimicrobial agents. Biofilm infections cause so many deaths all around the world and additionally high medical expenses as well. Use of medical devices and implants are the main sources of biofilm formation on human body. The aim of this study is to investigate the effects of exposure to Extremely Low Frequency Electromagnetic Fields (ELF-EMF) both on biofilm formation and on mature biofilm of Staphylococcus epidermidis (Gram +) and Pseudomonas aeruginosa (Gram -) which cause infections. These pathogens lead to infections by simply targeting and weakening the immune system. Choosing two bacteria forms contributes simply to enlarge the scope of application. Some species specific genes of S. epidermidis and P. aeruginosa are known to effect biofilm development. Consequently, AtlE gene sequencing of Staphylococcus epidermidis and rpoS gene sequencing of Pseudomonas aeruginosa is analysed in order to determine any genotypic changes caused by ELF-EMF exposure. P. aeruginosa is a Gram-negative, aerobic, rod-shaped bacterium with unipolar-motility. Cell-surface polysaccharides play a critical role on the life cycle of bacteria as they stand as barriers between the cell wall and surroundings. By doing so, they mediate interaction between the layers and coating which eventually form the structural components of biofilms. On the other hand, S. epidermidis is a gram-positive and coagulase-negative staphylococcus. Most commonly, it lives on the human skin and mucosa. Catheters and implants can be infected by Staphylococcus species easily. There are several approaches used to remove biofilm pathogens. Regarding the pathogens related to medical devices, one of the main strategies is to use systemic therapies with antimicrobial agents. However, it is rather difficult to prevent infections on implants as they are strongly resistant to antibiotics. Therefore, in order to succeed the therapy, the medical device should be removed from the implant. Another method for fighting the biofilm related infections is forming special functional surfaces. Clearly it is expected that these surfaces will prevent bacterial adhesion. In the past, mainly toxic materials have been used for the protective coating. However, today, because of environmental awareness, their use is very much limited, almost vanished. For the same aim, yet another approach is well known quorum-sensing which technically corrupts the communication mechanism of bacteria, so that the bacteria fail to form biofilms. Although there are some successful outcomes where synthetic analogs are used in natural structures, clinical trials could not be done because of the toxic products. Besides, a small range of pathogens could be targeted by quorum-sensing mechanisms. In several in vitro studies, it is observed that phages also infect biofilm forming cells. Phages inducing the production of depolymerases have an advantage, since they can penetrate the inner layers of the biofilm by degrading components of the biofilm exopolymeric matrix. However, phages should be integrated to implants in order to be used clinically. Also phages require prior identification of the phage or polysaccharide depolymerase capable of infecting the bacterial cells and degrading the polysaccharide within the biofilm. There has been an extended research on whether electromagnetic fields have any effect on the cells behavior. For this purpose, some studies have been carried out on animal models (in vivo) and cell cultures (in vitro). However, the findings are still inconclusive. On the other hand, some effects are observed with the application of electromagnetic field on biofilms. Biofilm formation is halted when electromagnetic fields with specific range of frequency are applied. This would be an alternative approach for the removal of biofilm considering the problems faced with the conventional approaches. Taking the originality point of the work into consideration, production and prevention of biofilms are achieved at two different surfaces and P. aeruginosa and S. epidermidis type bacteria are tested with the application of ELF-EMF. This research is mainly composed of three steps: i) controlled biofilm formation with two different model microorganisms Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus epidermidis; ii) removal and/or prevention of biofilms by exposure to extremely low frequency electromagnetic fields (ELF-EMFs); iii) AtlE gene sequencing of S. epidermidis and rpoS gene sequencing of P. aeruginosa exposed to ELF-EMF were performed so as to determine any genotypic changes. A microtiter plate biofilm assay is used to monitor microbial attachment to an abiotic surface, which is a high-throughput method often referred to as the 96-well plate assay. In brief, cells are grown in microtiter dishes for a desired period of time, and then the wells are washed to remove planktonic bacteria. Cells remaining adhered to the wells are subsequently stained with a dye that allows visualization of the attachment pattern. Then, this surface-associated dye is solubilized for semi-quantitative assessment of the formed biofilm. In order to emit ELF-EMFs, an experimental set-up was designed. The proposed experimental set-up consists of a solenoid that has 160 mm internal and 170 mm external diameter, with a length of single stranded 440 mm, 180 turns of copper wire. The device is supposed to deliver variable, homogeneous, sine-wave alternating magnetic fields regulated and defined along the center line with 45–300 Hz frequency and intensities ranging between 0.1 and 1.0 mT ±2%. The solenoid is powered by a power supply which is capable of forming a sine-wave output with a closely regulated frequency and voltage. Proposed experimental set-up consists of polystyrene and polypropylene microtiter plates for biofilm growth placed at the center of the cylindrical Solenoid, where assuming that the maximum homogeneity of electromagnetic field is obtained. To investigate Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus epidermidis biofilm formation, each strain is inoculated in two different round-bottomed 96-well microtiter plates that are polystyrene and polypropylene in structure. Two separate biofilm formations of P. aeruginosa and S. epidermidis, one of each exposed to ELF-EMF within the Solenoid and the others used as controls, are incubated at room temperature and analyzed for 24 h and 48 h. P. aeruginosa and S. epidermidis, exposed to 45 Hz, 50 Hz, 100 Hz, 200 Hz and 300 Hz frequency with 1 mT intensity are analysed for their biofilm formation on polystyrene and polypropylene surfaces. In order to explore the effect of EMF-ELF on rpoS and atlE genes, genomic DNA of ELF-EMF exposed bacteria were isolated. Then rpoS and atlE genes, which are responsible for biofilm development were sequenced and analysed for any DNA mutations. For DNA sequencing, such as those involving genomic DNA isolation, forward and reverse primer design, PCR, agarose gel electrophoresis and DNA sequencing, standard procedures were followed. ELF-EMF exposed cultures and the respective sham exposed controls were studied for DNA sequence analysis. Exposure of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus epidermidis to 45 Hz and 50 Hz at 1.0 mT decrease the cell viability and inhibit the biofilm formation by 40% after 48 hours, both on polystyrene and polypropylene surfaces. Conversely, there is no significant difference to biofilm formation both on polystyrene and polypropylene surfaces exposed to 100 Hz, 200 Hz and 300 Hz frequency and 1 mT intensity of ELF-EMF. Quantification of ELF-EMF (1mT 50 Hz) effect at 3 hr time intervals over 48 hrs, showed that the formation of S. epidermidis biofilm is halted by ELF-EMF exposure after 24 hrs, as similar growth is obtained between 24 hrs and 48 hrs time intervals. Nevertheless, ELF-EMF has significantly little effect on planktonic P. aeruginosa cultures, as the cells continued growing both at 24 hrs and 48 hrs compared to non-exposed control samples. With regard to the analysis of rpoS and atlE genes, similar DNA sequence profiles were observed in each experimental condition examined both in exposed and non-exposed cultures during biofilm formation.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    506666

    Isolation of novel Quorum quenching bacteria for the control of membrane biofouling and the effect of Bacillus sp. T5 and Delftia sp. T6 on microbial community structure in membrane bioreactor

    Membran biyotıkanmasının kontrolü amacıyla yeni Quorum quenching bakterilerinin izolasyonu ve Bacillus sp.T5/Delftia sp. T6 türlerinin membran biyoreaktördeki mikrobiyal komüniteye etkisinin belirlenmesi

    BAHAR YAVUZTÜRK GÜL

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    Biyomühendislikİstanbul Teknik Üniversitesi

    Çevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. İSMAİL KOYUNCU

  2. Tez No

    486734

    A syntethic biology approach for engineered functional biofilms

    Tasarlanmış fonksiyonel biyofilmler için sentetik biyoloji yaklaşımı

    EBUZER KALYONCU

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    Biyomühendislikİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Malzeme Bilimi ve Nanoteknoloji Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. URARTU ÖZGÜR ŞAFAK ŞEKER

  3. Tez No

    689776

    Süt endüstrisinde termofilik bakterilerin biyofilmlerinin kontrolünde doğal uygulamalar

    Natural applications in controlling the biofilm of thermophilic bacteria in the dairy industry

    KÜBRA TUTKUN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    BiyolojiGebze Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MELTEM YEŞİLÇİMEN AKBAŞ

  4. Tez No

    715098

    Salmonella typhimurium'da CsgD regülasyonunun otoindüktör-2 aktivitesine ve quorum sensing ilişkili küçük RNA'ların ekspresyon seviyelerine etkilerinin belirlenmesi

    Determination of the effects CsgD regulation on autoinducer-2 activity and expression levels of quorum sensing related small RNAs in salmonella typhimurium

    MELİH AŞAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    BiyoteknolojiAnkara Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NEFİSE AKÇELİK

  5. Tez No

    403304

    Controlling biofilm and persister cells by targeting cell membranes

    Başlık çevirisi yok

    ALİ ADEM BAHAR

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    BiyomühendislikSyracuse University

    Prof. DACHENG REN

Geri Dön