Haloarcula hispanica'ya ait proteaz enzimlerinin escherichia coli'de rekombinant olarak üretilmesi ve analizi
Recombinant production and analysis of haloarcula hispanica's proteases enzymes into escherichia coli
- Tez No: 551464
- Danışmanlar: PROF. KADİR TURAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Serin Proteaz, Proteaz, H. hispanica, Halofilik, Rekombinant, Serin Proteaz, Proteaz, H. hispanica, Halofilik, Rekombinant
- Yıl: 2019
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Marmara Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyokimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 169
Özet
Amaç: Farklı organizmalardan elde edilen proteolitik enzimler endüstrinin değişik alanlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu tez çalışmasında, ekstremofil özellik gösteren ve çoğalmak için özel koşullar gerektiren H. hispanica'ya ait proteaz genlerini, üretilmesi daha kolay ve ucuz olan Escherichia coli hücrelerine aktarmak, bu hücrelerde proteaz enzimlerini rekombinant olarak üretmek ve proteolitik aktivitelerini analiz etmek amaçlandı. Gereç ve Yöntem: H. hispanica genomunda proteaz ve serin proteaz geni okuma çerçevesi olarak tanımlanan DNA bölgeleri PZR tekniği ile çoğaltıldı ve E. coli hücreleri için geliştirilen, farklı kontrol bölgelerine sahip plazmit vektörlere (pET-14b, pBluescript II SK+ ve pAK-Taq) klonlandı. Klonlanan genlerin doğrulukları DNA dizi analizleri ile saptandı. Rekombinant proteaz enzimlerinin E. coli hücrelerinde sentezi SDS-PAGE teknikleri ile analiz edildi. Enzim aktiviteleri, hücrelerin milk-agar besiyerinde oluşturdukları üreme zonlarına ve hücrelerden hazırlanan lizatların BSA'yı ve/veya azokazein substratı hidroliz etme özelliklerine bakılarak değerlendirildi. Bulgular ve Sonuç: Farklı promotör dizileri kontrolünde klonlanan H. hispanica proteaz genlerinin nukleotit dizilerinin doğruluğu DNA dizi analizleri ile ortaya kondu. H. hispanica proteaz geninin denenen farklı E. coli suşlarında istenilen düzeylerde ekspresyon yapmadığı görüldü. Buna karşın serin proteaz geninin T7 bakteriyofaj promotörü kontrolünde, E. coli BL21 hücrelerinde, diğer hücresel proteinleri ile karşılaştırıldığında yüksek düzeylerde ekspresyon yaptığı saptandı. Bununla birlikte rekombinant serin proteazın hücrelerde inaktif inklüzyon cisimleri halinde biriktiği belirlendi. Rekombinant serin proteazın çözünür forma dönüştürülmesinde kısmen başarı sağlansa da, istenilen düzeylerde enzim aktivitesi saptanamadı. E. coli hücrelerinde etkin olarak sentezlenen H. hispanica serin proteaz enziminin tekrar aktif forma katlanmasına yönelik çalışmalar sürdürülmektedir.
Özet (Çeviri)
Aim: Proteolytic enzymes isolated from different organisms are widely used in a various fields of the industry. In this thesis, it was aimed to transfer the protease genes of extremophilic Haloarcula hispanica to Escherichia coli that is easier ve cheaper to produce, recombinantly produce the proteases ve to analyze their proteolytic activities. Materials ve Methods: The DNA fragments described as proteases open reading frame on H. hispanica genome were amplified by PCR ve cloned into the E. coli plasmids (pET-14b, pBluescript II SK + ve pAK-Taq) having different control elements. Accuracy of the genes was determined by DNA sequencing. Recombinant proteases synthesed in E. coli was analyzed by SDS-PAGE techniques. Enzyme activities were evaluated by checking of hydrolysis of the BSA ve/or azokazein with the cell lysates ve the zones of cells growing on milk-agar medium. Results ve Conclusion: The accuracy of the H. hispanica proteases genes cloned under the control of different promoters was demonstrated by DNA sequencing. H. herpanica protease gene did not express at the desired levels in the different E. coli strains tested. In contrast, the serine protease gene under the control of T7 promoter was expressed at high level comparing with other cellular proteins in E. coli BL21. However, it was determined that the recombinant serine protease accumulates as inactive inclusion bodies in the cells. Although it was partially successeded in converting the recombinant serine protease to the soluble form, the desired enzyme activity could not be detected. Efforts are going on to refolding of the serine protease into the active form, which is effectively synthesized in E. coli cells.
Benzer Tezler
- Halofilik mikroorganizmalara ait lipaz enzimlerinin Escherichia coli'de üretilmesi ve analizi
Production and analysis of lipase enzymes of halophilic microorganisms in Escherichia coli
ABDOULIE O. TOURAY
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
BiyokimyaMarmara ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYŞE OGAN
PROF. DR. KADİR TURAN
- DNA'nın arkeozomlarla formülasyonu, in vitro karakterizasyonu ve memeli hücre kültürlerinde taşıyıcı olarak kullanılması
Formulation and in vitro characterization of DNA with archaeosomes and its utilization as DNA carrier to mammalian cell cultures
AZADE ATTAR
Doktora
Türkçe
2010
BiyokimyaYıldız Teknik ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. KADİR TURAN
DOÇ. DR. SEVİL YÜCEL
- Arkeik bir bakteri olan Haloarcula hispanica 2TK2 suşundan alfa amilaz üretimi
Production of alfa amylase from Haloarcula hispanica 2TK2 strain that is a kind of archaebacteria
AYTUN NİLAY ERDAĞI
Yüksek Lisans
Türkçe
2013
BiyomühendislikYıldız Teknik ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. SEVİL YÜCEL
- Halofilik mikroorganizmalar olan Pseudomonas halophila DSM 3050 ve Haloarcula hispanica ATCC 33960'da glutatyon S-transferaz (GST) enziminin optimizasyonu ve spesifik aktivitesinin belirlenmesi
Determination of glutathione S-transferase (GST) specific activity and optimization of enzyme in halophilic microorganisms Pseudomonas halophila DSM 3050 and Haloarcula hispanica ATCC 33960
AYŞE ÇAKIR
Yüksek Lisans
Türkçe
2012
BiyokimyaAnadolu ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. KIYMET GÜVEN
YRD. DOÇ. DR. ELİF ÖZTETİK
- Halofilik arkeal kaynaklı lipaz üretim koşullarının optimizasyonu ve aktif lipazın saflaştırılması
Optimisation of halophilic archaeal lipase production media and purification of the active lipase
MELİS ÖZGEN
Yüksek Lisans
Türkçe
2016
BiyomühendislikYıldız Teknik ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SEVİL YÜCEL
DR. AZADE ATTAR