RNA silencing mediated resistance against plum pox virus
Şarka virüsüne (Plum pox) karşı RNA sessizleştirilmesiaracılığıyla direnç geliştirilmesi
- Tez No: 556347
- Danışmanlar: PROF. DR. MİKAİL AKBULUT, DOÇ. DR. KAHRAMAN GÜRCAN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Şarka virüsü, RNA sessizleştirilmesi, Direnç, SiRNA, Derin dizileme, Plum pox virus, RNA silencing, Resistance, siRNA, Deep sequencing
- Yıl: 2019
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Erciyes Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 160
Özet
Plum Pox Virüsünün Dideron (D), Marcus (M) ve Türkiye (T) ırkını da içeren farklı ırklarının Türkiye'nin değişik bölgelerinde oldukça yaygın oluşu ve kayısı gibi taş çekirdekli meyvelerin ülke için ekonomik önemi, PPV direnç programına ihtiyaç olduğunu vurgulamaktadır. Bu çalışmada, bu virüse karşı direnç geliştirmek amacıyla gen sessizleştirmesi yaklaşımını değerlendirmek için PPV-T genomundan elde edilen UTR/P1 (752), P1/HCPro (771), HCPro (649) HCPro/P3 (594) ve CP (990 bç) bölgelerini kapsayan 5 bölgesi, saç tokası konsraktı hazırlamak amacıyla PCR ile çoğaltılmıştır. Konstraktın bir model bitki olan Nicotiana benthamianaya aktarılması için Agrobacterium aracılı transformasyon sistemi kullanılmıştır. Rejenere edilen Nicotiana benthamiana bitkisinden neomycin phosphotransferase ve aktarılan spesifik gen bölgelerinin PCR ile çoğaltılması transformasyonun başarılı bir şekilde yapıldığını teyit etmiştir. Transformasyonun gerçekleştiği, saç tokası konstraktının her iki koluna klonlanan parçaların dizilenmesi ile daha ileri düzeyde doğrulanmıştır. Transgenic Nicotiana benthamiana bitkilerinde virüs direncinin etkinliğini değerlendirmek amacıyla PPV-D, PPV-T ve PPV-M ile inokule etmek için T1 hattı serada yetiştirilmiştir. Semptomların gözlenmesi ve ELISA test sonuçlarına göre UTR/P1 ve CP saç tokası konstraktını içeren çok sayıda transgenik hat, bir HCPro ve HCPro/P3 saç tokası konsraktı içeren 2 hat PPV'ye direnç göstermiştir. P1/HCPro saç tokası konstraktını taşıyan bitkilerin çoğunluğu direnç deneylerinde PPV semptomu göstermiş olup dirençli bulunmamışlardır. Transgenik bitkilerde RNA aracılı gen susturma yoluyla savunma olgusunun daha iyi anlaşılmasını sağlamak ve saç tokası yapılarının transgenden türeyen suni Si-RNA üretimindeki potansiyellerini karşılaştırmak için, transgenik ve yabani tip bitkilerdeki SiRNA ve miRNA ifade profilleri yüksek verimli küçük RNA dizilemesi ile analiz edilmiştir. Enfekteli ve enfektesiz yabani tip bitkilerin miRNA ifade profillerinin karşılaştırılması, PPV infeksiyonunun bazı miRNAlar'ın ifadelerinin aşağı ve yukarı yönde düzenlenmesine öncülük ettiğini ortaya çıkarmıştır. Transgenik dirençli bitkilerde tahmin edilen miRNA hedef genlerinin gen ontoloji (GO) analizleri, savunma tepkisini de içeren farklı biyolojik tepkilerle ilişkili genlerin frekansında azalma olduğunu göstermiştir. Transgenik bitkilerin, HCPro (orta derecede dirençli) saç tokası konstraktını taşıyan transgenik bitkiler hariç, tahmin edilen miRNA hedef genlerinin zenginleştitilmiş GO şartları, enfekteli olmayan yabanıl bitkilerin zenginleştirilmiş GO şartları ile benzer desen göstermiştir. Bu durum, dirençli transgenik bitkilerde uyarılmış RNAi den kaynaklanan PPV infeksiyonunun yerleşmesinin önlenmesi şeklinde yorumlanabilir. Ek olarak, transgenik bitkilerde siRNA analizi, siRNAların üretilmesi ve hedef bölgelerde birikmesinde bu saç tokası yapılarının çeşitli potansiyellerini ortaya çıkartmıştır. Bu çalışma, PPV genomunun en yaygın bölgelerini RNA sessizleştirmesinin uyarılması ve oluşturulan siRNA türlerinin taranması için de derin dizilim analizini kullanan ürünün ilk çalışmasıdır. Transgenik bitkilerdeki uyarılmış siRNAlar'ın karakterizasyonu, UTR/P1 ve CP saç tokası yapılarının siRNA üretimi ve hedef bölgelerde birikiminde daha yüksek kapasiteye sahip olduğunu göstermekte ve bu genom bölgelerinin taş çekirdekli meyvelerde transformasyon için en iyi aday olduklarını belirtmektedir.
Özet (Çeviri)
Widespread presence of different strains of Plum pox virus (PPV), including Didron (D), Marcus (M) and Turkey (T), in different regions of Turkey and the economic importance of stone fruit hosts such as apricots for the country, highlight the necessity of the PPV resistance program s . In this research, to evaluate gene-silencing approach in producing resistance against this virus, five genomic regions including UTR/P1 (752 pb), P1/HCPro (771bp), HCPro (649 bp), HCPro/P3 (594 bp) and CP (990bp) derived from PPV-T were amplified by PCR for preparation of hairpin constructs using the Gateway system. The Agrobacterium-mediated transformation system has been used to introduce the constructs to model plant, Nicotiana benthamiana. PCR amplification of neomycin phosphotransferase II (nptII) gene and the specific genes from regenerated N. benthamiana confirmed the successful transformation procedure. In addition, for further confirmation sequencing of insert genes in each arm of hairpin constructs was performed. In order to evaluate the efficiency of virus resistance, the transgenic N. benthamiana T1 lines were grown in greenhouse to be inoculated with PPV-D, PPV-M and the PPV-T strains. Based on symptom observation and ELISA test results, several lines of transgenic plants harboring the hairpin constructs UTR/P1 and CP, one line of HCPro and two lines of HCPro/P3 containing hairpin constructs showed the highest level of resistance against PPV infection. The majority of transgenic plants containing the P1/HCPro hairpin construct showed PPV symptoms in resistance assay indicating that they were not resistant. Aiming to gain a deeper insight about the RNA-mediated gene silencing defense process in transgenic plants and comparing the potential of hairpin structures in production of transgene-derived siRNAs, the expression profiles of siRNAs and miRNAs in both wild-type (infected and un-infected) and transgenic plants were determined by small RNA high-throughput sequencing. Comparison of miRNA expression profiles of infected and un-infected wild-type plants revealed that PPV infection led to up/down regulation of some miRNAs. The gene ontology (GO) analysis of predicted miRNA target genes revealed decrease in frequency of genes involved in different biological responses including defense response. In transgenic resistant plants, except for transgenic plants harboring HCPro hairpin construct (moderately resistant), the enriched GO terms of predicted miRNA target genes showed a similar pattern to the enriched GO terms of un-infected wild-type plants. This may be interpreted by prevention of PPV establishment in resistant transgenic plants resulting from induced RNAi. In addition, siRNA analysis in transgenic plants revealed various potentials of these hairpin structures in producing siRNAs and their accumulation on target regions. This is the first study of its kind which compares the most common PPV genomic regions used for induction of RNA silencing against PPV by deep sequencing analysis for screening of the siRNA species. Characterization of produced siRNAs in transgenic plants indicated that UTR/P1 and CP hairpin structures with higher capacity of production of siRNAs and dense accumulation of them on target regions are, to date, the best candidates for transformation of stone fruit plants.
Benzer Tezler
- Marul mozaik virüsü, marul nekrotik bodurluk virüsü ve marul nekrotik sarılık virüsü'nü hedefleyen miRNA'ların in siliko yaklaşımlarla belirlenmesi
Determination of miRNAs targeting lettuce mosaic virus, lettuce necrotic stunt virus and lettuce necrotic yellows virus using in silico approaches
EDA ÖZKESER
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
Bilim ve TeknolojiYıldız Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. SEVGİ MARAKLI
- The molecular mechanism of BRPF proteins for the reversion of taxane resistance in prostate cancer
BRPF proteinlerinin prostat kanserinde taksan direncini geri çevirmedeki moleküler mekanizması
BEYZA DEDEOĞLU AYDIN
Yüksek Lisans
İngilizce
2023
BiyolojiKoç ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. CEYDA AÇILAN AYHAN
- Identification of chromatin related genes regulating temozolomide resistance in GBM
GBM'de temozolomid direncini düzenleyen kromatin ile ilişkili genlerin belirlenmesi
FİLİZ ŞENBABAOĞLU
- Glioma hücrelerinde rosmarinik asitin antikanser moleküler mekanizmalarının araştırılması
Investigation of anticancer molecular mechanisms of rosmarinic acid in glioma cells
ASLIHAN ŞENGELEN
Doktora
Türkçe
2023
Biyolojiİstanbul ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EVREN ÖNAY UÇAR
- Pseudomonas aeruginosa kökenlerinde lipid metabolizması ve antibiyotik direncinde rol alan ACPP ve mMEXA genlerinin antisens oligonükleotitler ile susturulması
Silencing acpp and MEXA genes which take part in lipid metabolism and antibiotic resistance in pseudomonas aeruginosa isolates BY antisense oligonucleotids
YAMAÇ TEKİNTAŞ
Doktora
Türkçe
2018
MikrobiyolojiEge ÜniversitesiFarmasötik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MİNE HOŞGÖR LİMONCU