Geri Dön

Recombinant production and characterization of serine protease enzyme from Virgibacillus sp. AGTR strain

Virgibacillus sp. AGTR suşundan izole edilen serin proteaz enziminin rekombinant üretimi ve karakterizasyonu

PDF İndir

  1. Tez No: 603527
  2. Yazar: BEGÜM ÖZDEN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Biotechnology, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2019
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 73

Özet

Enzimler yer aldıkları spesifik reaksiyonların aktivasyon enerjisini, herhangi bir kalıcı değişime uğramadan düşüren ve reaksiyonun gerçekleşme hızını arttıran biyomoleküllerdir. Endüstriyel alanda sürdürülebilirlik için çevreye zarar vermeyen biyolojik temelli üretimler hedeflenmektedir. Enzimler endüstriyel üretimlerde kullanılan sayısız biyoreaksiyonda yer almaları, biyolojik olarak bozunabilir olmaları ve toksik olmayan doğaları nedeniyle tehlikeli kimyasal kirleticilere alternatif olarak kullanılırlar. Üretim reaksiyonları için gerekli enzimlerin tümü, ekstrem endüstriyel koşullara dayanamayabilir veya istenilen verimde çalışmayabilirler. Rekombinant DNA teknolojisi endüstriyel alanda istenilen özellikte biyomoleküllerin kullanılabilmesini mümkün kılar ve üretimde en yüksek verime ulaşabilmek için çeşitli geliştirmelerin yapılabilmesine de olanak tanır. Özellikle mikrobiyal kaynaklı enzimler; stabiliteleri, katalitik aktiviteleri, üretim ve optimizasyonlarının bitkisel ve hayvansal kaynaklı enzimlere oranla kolaylığı sebebiyle endüstriyel alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Çeşitli proseslerde maliyeti düşürmeleri, toksik olmayan ve çevre dostu özellikleri nedeniyle ekonomik değerleri oldukça yüksektir. 2014 yılında yaklaşık 4,2 milyar dolar küresel pazara sahip olan endüstriyel enzimlerin pazar payı her yıl ortalama % 7 oranında artış göstermektedir. Endüstriyel yolla üretilen enzimlerin yaklaşık dörtte üçü gıda, deterjan ve nişasta endüstrisi tarafından kullanılmaktadır. En büyük pazar payına deterjan içeriklerinde kullanılan enzimler sahipken, bu alanda mevcut kaynaklara ek olarak yeni kaynaklar aranmaktadır. Yapılan birçok araştırmayla birlikte enzimlerin kullanım alanları her geçen gün genişlemektedir. Ekstremofilik organizmalar bu doğrultuda yeni enzimlerin keşfi veya daha verimli prosesler için farklı optimal şartlarda çalışabilen enzimlerin üretimi açısından ciddi potansiyele sahiptir. Yüksek tuz konsantrasyonunda ve / veya düşük su içerikli ortamlarda daha iyi verimlilik ve stabilite özellikleri olan yeni enzimler endüstriyel üretimler için pek çok avantaj sağlamaktadır. Bu enzimler için ekstremofilik mikroorganizmalarda, özellikle halofilik ve halo-tolerantlarda çalışmalar yapılmaktadır. Halofilik enzimler halofil organizmalar tarafından üretilen ve genellikle katalitik aktiviteleri için NaCl varlığına ihtiyaç duyan proteinlerdir. Halotolerant proteinler geniş bir NaCl konsantrasyonunda ve düşük su aktivitesine sahip ortamlarda aktif kalırlar. Metagenomiks yaklaşımı mikrobiyal dünyayı anlamamızda temel bilgiler sağlamanın yanı sıra; enerji, tarım, biyoteknoloji ve tıp gibi birçok alanlarda pratik yeni uygulamalar geliştirilmesini sağlayabilecek bir teknoloji sunmaktadır. Doğada bulunan mikroorganizmaların % 98'i kültüre edilememektedir. Metagenomiks, kültüre edilemeyen bu mikroorganizmaların genomlarını kültüre etmeden karakterize edebilmemizi mümkün kılmaktadır. Metagenomiks yaklaşımı, ekstrem koşullarda klasik metodlar ile belirlenemeyen mikroorganizmalardan ekstremofilik yeni enzimlerin araştırılmasına ve izolasyonuna imkan verecektir. Çevresel örneklerdeki ekstremofilik mikroorganizmalardan elde edilmiş metagenomlar sayesinde çeşitli enzimler ile ilgili elde edilen bilgiler epey genişlemiştir. Ülkemizde de halofilik enzimlerin keşfedileceği pek çok doğal çevre bulunmaktadır. Afyon, Denizli ve Burdur il sınırları arasında bulunan Acıgöl yüksek tuz konsantrasyonuna sahip olması sebebiyle halofilik mikroorganizmaların ve dolayısıyla halofilik enzimlerin keşfi için önemli bir göldür. Grubumuz tarafından bu alanda devam eden, Acıgöl'ün mikrobiyal çeşitliliğini ortaya koyan çalışmalar yapılmış, halofilik enzim üreticisi olma potansiyeli olan pek çok mikroorganizmaya ev sahipliği yaptığı gösterilmiştir. Proteazlar, alınan besinlerdeki proteini, polipeptit zincirlerindeki amid bağlarını hidrolizleyerek parçalarlar. Yalnızca diyet protein sindiriminde ve hücresel protein döngüsünde değil, aynı zamanda organizmanın düzgün çalışması için önemli olan sayısız metabolik ve düzenleyici süreçlerde de yer almaktadırlar. Yaşam döngüsündeki önemli düzenleyici rolleri nedeniyle, proteazlar tıbbi araştırma ve yeni ilaç dizaynları için önemli hedefler haline gelmiştir. Bunun dışında özellikle mikrobiyolojik orijinli enzimler gıda, yem, tekstil ve deri endüstrisinde geniş çapta kullanılmaktadırlar. Medikal terapilerde ve kozmetolojide giderek daha fazla uygulanmaktadırlar. Proteazların farklı sınıfları kanser vakalarında prognostik belirteçler olarak tedavi gelişimlerine yardımcı olabilmektedirler. Elde edildikleri kaynaklara göre bakteriyel proteazlar, sanayide kullanılan proteazların % 60'lık dilimini oluşturmaktadır. Kullanım alanlarının genişliği araştırmacıları ekstremofilik proteazlarla ilgili çalışmalara yöneltmiştir. Ekstremofillerden izole edilen proteazlar, arzu edilen benzersiz özellikleri nedeniyle büyük bir pazar değerine sahiptir. Ekstremofilik proteazların kaynakları, özellikleri ve yapısal adaptasyonları oldukça çeşitlilik göstermektedir. Tuza bağlı ekstraselüler proteaz üreten mikroorganizmalar, tuzlu su ve hiper tuzlu göllerden, deniz suyundan ve derin denizlerden izole edilen arkeler, bakteri ve ökaryotlardan elde edilirler. Fizyolojik önemleri yanında, ticari alanlarda da yüksek uygulama potansiyeline sahip enzim sınıfını oluştururlar. Bu sebeplerden dolayı çalışma alanımız olan Acıgöl yeni ektremofilik proteazların keşfi için uygun bir ortamdır. Katalitik mekanizmalarına göre, proteazlar altı gruba ayrılır: aspartik, sistein, glutamik, metallo, serin ve treonin. Serin proteazlar en bol görülen proteazlardır ve muazzam sayıda biyolojik işleme katılırlar. Tüm proteazların yaklaşık üçte birini oluşturan serin proteazlar aktif bölgelerindeki nükleofilik Ser kalıntısı sebebiyle bu şekilde adlandırılırlar ve alkali pH civarında maksimum aktivite gösterirler. Serin proteazların çalışma mekanizması ve reaksiyonlarının ara kademeleri hakkında diğer enzimlere oranla daha fazla deneysel kanıt vardır. Doğal yollarla oluşmuş bazı polipeptid inhibitör komplekslerinin ve tripsinin kristal yapılarının çözülebilmiş olması serin proteazların yapılarının iyi bilinmesinin asıl sebebidir. Yaklaşık 40 aileye sınıflandırılabilen serin proteazlar Asp-His-Ser“katalitik üçlüsünün”varlığıyla ayırt edilebilirler ve yapılarına göre iki geniş kategoriye ayrılırlar: kimotripsin benzeri (tripsin benzeri) veya subtilisin benzeri serin proteazlar en bilinen örnekleridir. Bugüne kadar, farklı organizmalardan birçok proteolitik enzim izole edilerek, karakterize edilmiş ve bazıları endüstriyel olarak üretilmiştir. Protein mühendisliği teknikleri kullanılarak veya ekstremofilik organizmalar kullanılarak daha aktif ve kararlı enzimler elde edilmiştir. Bununla birlikte, yeni özelliklere sahip proteazların endüstriyel kullanımı hala önemli bir ihtiyaçtır. Daha önceki çalışmalarımızda yüksek tuz içeriğinden dolayı aşırı tuzlu (ekstremofilik) bir ortam olarak kabul edilen Acıgöl'den elde edilen sediment örneklerinden Virgibacillus sp. AGTR suşu tanımlanmıştır. Virgibacillus sp. AGTR suşu genom dizilemesine göre 3 farklı serin proteaz enzimi gen bölgesi bulundurmaktadır. Bu tez kapsamında, 1293 bp uzunluğundaki serin proteaz enzimini kodlayan gen bölgesi Serine-1 olarak isimlendirilerek rekombinant protein üretimi için seçilmiştir. İlgili enzimin nükleotid dizilimi BLASTn veritabanındaVirgibacillus sp. Bac332 ile % 100 örtüşmektedir. Bununla birlikte literatürde enzimle ilgili herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Bu sebeple çalışmamızda moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak Serine-1 enziminin rekombinant üretimi ve karakterizasyonu amaçlanmıştır. Serine-1 geni uygun primerler dizayn edildikten sonra uygun koşulları optimize etmek üzere gradient PZR ile amplifiye edilmiştir. Primer dizilerine dizayn aşamasında eklenen SacI ve EcoRI restriksiyon enzim bölgeleri sebebiyle PZR ile çoğaltılan Serin-1 gen bölgesi aynı zamanda bu kesim enzimi bölgelerini de içermektedir. Bu sayede kullanılan pET-28a (+) vektörü ve amplikon ikili enzim kesim reaksiyonuna tabi tutulmuştur. Kesim reaksiyonu sonunda hem vektör hem de amplikon dizilerinde yapışkan uçlu kısımlar oluşmuş ve T4 DNA ligaz enzimi ile ligasyon reaksiyonu gerçekleştirilmiştir. Reaksiyon ürünü E.coli C43 (DE3) ekspresyon hücresine aktarılmıştır ve kanamisin içeren LB petrilerde koloniler büyütülmüştür. Transformantlar plazmid izolasyonu yapılmak üzere seçilmiş ve aynı zamanda -80 °C'de saklanmak üzere gliserol stoklar oluşturulmuştur. Plazmid izolasyonu gerçekleştirildikten sonra, plazmidin ilgilenilen gen parçasını içerip içermediği EcoRI kesimi ile kontrol edilmiştir. Agaroz jel elektroforezinde istenilen boyuttaki plazmidi içeren transformantlar seçilerek Sanger metodu ile dizilenmiştir. Sanger dizileme sonucunda 330. bazda bir adenine bazı delesyonu görülmüştür. Serin-1 enziminin referans sekansı yeni nesil dizileme sonucundan gelmektedir. Yeni nesil dizilemelerde yanlış okumalar ve bazı baz yanlışlıkları olabilmektedir. Sanger dizilemenin ise 500-700 baz civarındaki kısa dizilerde doğruluk oranının yeni nesil dizilemeye nispeten yüksek olduğu bilinmektedir. Bu sebeple ilk olarak Sanger dizileme sonucunda görülen adenine bazı eksikliğinin bir mutasyon değil de, yeni nesil dizilemedeki bir yanlışlıktan kaynaklandığı düşünülmüş ve protein ekspresyonu aşaması başlatılmıştır. Protein ekspresyonunun hangi IPTG konsantrasyonunda optimum olduğunu belirlemek üzere 0,1, 0,5 ve 1 mM IPTG ile 30°C'de 1,2,4 ve 6 saat boyunca indüklemeler yapılmış ve en iyi sonuç 0,1 mM IPTG konsantrasyonu ile 4 saatte elde edilmiştir. Optimum şartların belirlenmesinin ardından ekspresyon bu şartlarda gerçekleştirilmiş ve protein saflaştırma aşamasına geçilmiştir. Protein pürifikasyonu için His-Tag metodu kullanılmıştır. Deney sonucunda Serin-1 enzimi elde edilememiştir. Bunun sebebinin dizide enzim sentezi öncesinde gerçekleşen adenin delesyonunun stop kodonun oluşturması olduğu düşünülmüştür. Bu mutasyonu aşmak için ileriki çalışmalarda protein mühendisliği yöntemleri kullanılarak diziye adenin bazı eklemesi yapılacaktır.

Özet (Çeviri)

Enzymes are used in many industrial applications because of their environmentally friendly features. Especially, proteases from microorganisms cover 60 % of the world market. They do not cause environmental pollution with their reactions. Proteases are classified according to their catalytic mechanisms. Alkali serine proteases are the largest enzyme group used in bioengineering because they can maintain their activities in wide range of environments such as high alkaline environments, different salt concentrations, high and low temperatures. This biochemical diversity of alkaline serine proteases enables their usage in many processes such as the detergent industry, leather processing steps, waste disposal. The metagenomics is one of the newest method to understand our microbial world and it provides to improve the new applications of agriculture, biotechnology, medicine and many other areas. Metagenomics presently offers a way to access unculturable microorganisms. Metagenomics involves extracting DNA directly from an environmental sample – e.g. seawater, soil, the human gut, mines, and brine-. 16S ribosomal RNA gene sequencing is the most widely studied approach in metagenomics. 16S rRNA, which is approximately 1.500 bp long, contains nine variable regions interspersed between conserved regions. Variable regions of 16S rRNA are frequently used in phylogenetic classifications such as genus or species in diverse microbial populations. A number of new microorganisms with important functionalities have been detected through this approach. The economic future of modern industrialized societies requires the development of new enzymes, molecules, products, and applications. Metagenomics can also be applied to solve practical challenges especially in the field of food, cosmetic, medicine. Acıgöl is a lake with high salt concentration at 836 m above sea level located between Afyon, Denizli and Burdur. Lake Acıgöl is characterized as an extreme environment due to its high salt content -approximately 75 g / L- and alkaline properties -pH is 8.6. Considering the biochemical properties of alkali serine proteases, it is a suitable environment for the discovery of microorganisms that produce such enzymes. In our previous studies, Virgibacillus sp. AGTR strain was identified from the sediment samples obtained from Lake Acıgöl, which is accepted as an extremely salty environment due to its high salt content. Virgibacillus sp. AGTR strain has 3 different serine protease enzyme gene regions according to genome sequencing. Within the scope of this thesis, the gene region encoding the serine protease enzyme which is 1293 bp length was named as Serine-1 and selected for the future characterization. The nucleotide sequence of the enzyme has 100 % identity with serine protease of Virgibacillus sp. Bac332in BLASTn database. However, there are not many studies on this enzyme in the literature. For this reason, in our study, we aimed at recombinant production and characterization of Serine-1 enzyme using molecular biology techniques. After the appropriate primers were designed, the Serine-1 gene was amplified by gradient PCR to optimize the appropriate PCR conditions. SacI and EcoRI restriction enzyme sites were added to the primer sequences at the design stage. Therefore, the Serine-1 gene was also contained these restriction enzyme regions after amplified by PCR. Thus, double digest reaction was set up for the vector pET-28a (+) and amplicon. At the end of the digestion reaction, the ends of the cut had an overhanging piece of single stranded DNA that is called 'sticky ends'. Digested vector and amplicon were ligated with T4 DNA ligase enzyme. The reaction product was transformed into the E.coli C43 (DE3) expression cell and colonies were grown in kanamycin containing LB broth. Transformants were selected for plasmid isolation. After plasmid isolation was performed, the EcoRI restriction enzyme was used to confirm insert ligation to the vector. Transformants which are containing the plasmid of the desired size were selected on agarose gel electrophoresis and the sequences were confirmed by Sanger sequencing. An Adenine base deletion was seen in the location of the 330th base as a result of Sanger sequencing. It was thought that this difference could be caused by an error in the whole genome sequencing. The accuracy of Sanger sequencing is higher than the whole genome sequencing in short sequences around 500-700 bp. Therefore, the sequencing was considered to be correct and the protein expression step was initiated. To determine optimum IPTG concentration for the Serine-1 protein expression, 0.1, 0.5 and 1 mM IPTG concentrations were applied for 1, 2, 4 and 6 hours at 30 °C and the best results were obtained at 4 hours at 0.1 mM IPTG concentration. After the determination of the optimum expression conditions, the gene was expressed under these conditions. The protein purification stages were conducted. The His-tag method was used for purification. However, Serine-1 protein could not be purified as a result of the experiment. It was observed that a stop codon was formed before the entire enzyme synthesis as a result of the adenine deletion. To overcome this mutation, an adenine base addition will be done using protein engineering methods in future studies.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    688848

    Recombinant production and characterization of serine protease enzyme from Virgibacillus sp. AGTR strain using site directed mutagenesis

    Virgibacillus sp. AGTR suşundan izole edilen serin proteaz enziminin bölgeye yönelik mutagenez yöntemi kullanılarak rekombinant üretimi ve karakterizasyonu

    EVRİM KAPUCU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

  2. Tez No

    619722

    Bacıllus halodurans c-125 alkalin serin proteazının üretimi, karakterizasyonu ve deterjan katkı maddesi olarak kullanımının araştırılması

    Production and characterization of bacillus halodurans c-125 alkaline serine protease and investigation of using as detergent additive

    AŞKIN TEKİN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2020

    BiyolojiKaradeniz Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. KAZIM SEZEN

  3. Tez No

    652860

    Prolil endopeptidaz (PEP) enziminin Escherichia coli ekspresyon sisteminde çözünür formda eldesi, saflaştırılması ve karakterizasyonu

    Obtaining, purification and characterization of soluble form of prolyl endopeptidaze (PEP) enzyme in Escherichia coli expression system

    NEJLA BAKIR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2020

    BiyomühendislikTokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. İSA GÖKÇE

  4. Tez No

    276439

    Amsacta moorei entomopoksvirüs protein kinaz geninin karakterizasyonu ve fonksiyonel analizi

    Functional analysis and characterization of protein kinase gene (AMV197) of Amsacta moorei entomopoxvirus

    HACER MURATOĞLU

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2010

    BiyolojiKaradeniz Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZİHNİ DEMİRBAĞ

  5. Tez No

    815755

    The productıon and pegylatıon of recombinant human granulocyte colony-stımulatıng factor produced ın e. coli

    Rekombinant insan granulosit koloni stimülan faktörünün e. coli'de üretimi ve pegilasyonu

    NAZLI DİLARA ERDOĞDU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY

Geri Dön