Geri Dön

The productıon and pegylatıon of recombinant human granulocyte colony-stımulatıng factor produced ın e. coli

Rekombinant insan granulosit koloni stimülan faktörünün e. coli'de üretimi ve pegilasyonu

PDF İndir

  1. Tez No: 815755
  2. Yazar: NAZLI DİLARA ERDOĞDU
  3. Danışmanlar: PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyokimya, Biyoteknoloji, Biochemistry, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2023
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 75

Özet

Bu tez iki farklı bölümden oluşmaktadır. Birinci bölüm Granülosit koloni uyarıcı faktörünün üretimi, saflaştırması ve pegilasyonunu konu almaktadır. Doğuştan gelen bağışıklık sistemi, kemik iliğinde oluşan miyeloid soyuna sahip hücrelerden oluşur. Miyeloid öncü hücreler, farklı hücre tiplerine farklılaşır; nötrofiller, monositler (makrofajlar ve dendritik hücreler), mast hücreleri, bazofiller ve eozinofiller. Bazofiller, nötrofiller ve eozinofiller, granülosit adı verilen bir hücre ailesi oluşturur. Viral olmayan bir enfeksiyon durumunda, bu hücreler patojene saldırır ve onları fagositoz yoluyla etkisiz hale getirir. Veziküller, asidik bir pH'ta (3.5-4.0) enzimler ve antimikrobiyal maddeler içeren granüller olarak da adlandırılır. Nötrofiller bağışıklık sisteminde vazgeçilmez bir role sahip oldukları için sayıları intrensik (transkripsiyon faktörleri) ve ekstrinsik yolaklarla (sitokinler ve büyüme faktörleri) düzenlenir. Nötrofiller, memeli sistemlerinde viral olmayan patojenlere karşı savaşan ana hücre grubudur. Nispeten daha büyük hücrelerdir ve 2-3 günlük nispeten daha kısa bir ömre sahiptirler. Nötrofiller kan dolaşımında en çok bulunan hücre tipleridir ve insan kan hücrelerinin %40-70'ini oluştururlar Enfeksiyon üzerine sitokinler endotel, makrofajlar ve mast hücrelerinden salınır. Nötrofiller, kemotaksis adı verilen bir süreçle enfeksiyon bölgesine alınır. Nötrofiller işe alındıktan sonra, sinyali daha da yükseltmek için sitokinleri de serbest bırakabilirler. Sinyal amplifikasyonu ve hücre alımı dışında, nötrofillerin patojenlere karşı üç farklı etki modu vardır; fagositoz, degranülasyon ve Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklarının (NET'ler) oluşumu. Fagositoz, opsonin kaplı hedeflerin tanındığı ve yutulduğu süreçtir. Bu süreç, sindirim için gerekli enzimleri ve reaktif oksijen türlerini içeren fagozomların oluşumuyla sonuçlanır. Degranülasyon, nötrofillerin granüllerinde bulunan antimikrobiyallerin ve sitokinlerin salgılanması işlemidir. NET'ler, nötrofiller tarafından oluşturulan ve serin proteazlar ve kromatinden oluşan ağ benzeri yapılardır. Bu oluşumların amacı antimikrobiyal yönünden zengin bir ortam oluşturmak ve aynı zamanda patojenin organizmada yayılmasını önlemektir. Kan dolaşımındaki anormal derecede düşük nötrofil konsantrasyonuna nötropeni denir. 70 kg ağırlığındaki sağlıklı bir yetişkin insanda ortalama nötrofil sayısı 1,5 X 109 hücre/L'nin üzerindedir. Hafif nötropenide hücre sayısı 1,0-1,5 X 109 hücre/L, orta nötropenide 0,5-1,0 X 109 hücre/L ve şiddetli nötropenide 0,5 X 109 hücre/L'nin altındadır. Nötropeni hastaları, endojen bakterileri tarafından enfekte olmaya karşı hassastır. Hastaların çoğu yaşamları boyunca orofarenks, gastrointestinal sistem ve cilt enfeksiyonları geliştirir. Nötropeni konjenital, döngüsel, besin eksikliğinden veya kanser tedavisinin bir yan etkisinden kaynaklanabilir. Nötropeni, miyelotoksik kemoterapinin önemli bir sonucudur ve bu nedenle onkolojik tedavinin bir yan etkisidir. Bu yan etkileri önlemek için terapötik madde olarak koloni uyarıcı faktör içeren ilaçlar kullanılır. Üç günlük kemoterapiden sonra uygulanan bu ilaçlar nötropeniyi önlemekte ve enfeksiyona bağlı ölümleri azaltmaktadır. Kostmann sendromu olarak da adlandırılan konjenital nötropeni, kan dolaşımındaki düşük nötrofil seviyesidir (0.2 X109 hücre/L). Bu otozomal resesif hastalık yenidoğanlarda görülür ve semptomları arasında yüksek ateş ve ciddi enfeksiyonlar yer alır. ELANE, HAX1, GFI1, G6PC3, WAS ve CSF3R genlerindeki mutasyonların konjenital nötropeninin nedeni olduğu bilinmektedir. Hematopoietik kök hücre farklılaşmasını fonksiyonel bir hücre tipine tetiklemekten sorumlu birkaç büyüme faktörü vardır. Kemik iliğinde granülosit farklılaşması, çoğalması ve hayatta kalmasından sorumlu olan sitokinlere Granülosit Koloni Uyarıcı Faktörler (G-CSF) denir. G-CSF proteinini kodlayan gen, 17. kromozomda 17 q11-22'de bulunur. CSF3 geni, 204 amino asit uzunluğundaki proteini kodlar ve bunların 30'u salgılanmak üzere endoplazmik retikulumu hedefleyen sinyal dizileridir. 174 amino asit uzunluğundaki protein, öncelikle monositlerden ve makrofajlardan, ayrıca endotel hücrelerinden, fibroblastlardan ve kemik iliği stromal hücrelerinden salgılanır. Doğru katlanmış formda, sistein kalıntılarının 5'i, 36-42 ve 64-74 kalıntıları arasında 2 disülfid bağı oluşturur ve 17. sistein serbest kalır. Proteinin %66'sını oluşturan dört paralel alfa heliks yapısı vardır. Proteinin teorik izoelektrik noktası (pI) 5.65'tir. Filgrastim, ana etken madde olarak G-CSF içeren ilaçtır. G-CSF'in küçük boyutu Filgrastim'in vücuttan çabuk atılmasına sebep olduğundan, yarılanma ömrü kısadır. Pegfilgrastim, filgrastime göre daha stabil ve daha uzun yarı ömürlü bir ilaçtır. Pegfilgrastim'in tek dozluk maliyeti filgrastim'den daha yüksektir, ancak daha uzun yarı ömür, daha düşük toplam maliyet ve daha kolay uygulama sağlar. Pegfilgrastim'in yüksek maliyeti, çok aşamalı saflaştırma ve ayrıca pegilasyon reaksiyonunda kullanılan toksik yan ürünlerin güçlükle uzaklaştırılmasından kaynaklanmaktadır. Bu tezin amacı, doz başına maliyeti daha da azaltmak için pegfilgrastim üretmenin daha kolay ve ucuz bir yolunu bulmaktır. Alkali tamponun daha yüksek bir çözünme verimine sahip olmasına rağmen, 5.5'in üzerindeki pH değerlerinde G-CSF'nin kararsızlığı nedeniyle süreç genel olarak uygun değildir. Çözünür protein yöntemi, bu yöntem elüsyonda daha fazla safsızlık verdiğinden elverişsizdi. Mutasyon, proteinin diyaliz adımlarındaki stabilitesini artırdı, ancak proteini daha yüksek verimle üretmek için yeterli olmadı. Sodyum siyanoborohidritin sodyum borohidrit ile ikamesi, sulu çözeltilerde kararlı olmadığı için başarılı olmadı. İkinci kısım CHEK2 yabanıl tip proteinin rekombinant olarak E. Coli'de üretimini konu almaktadır.Serin-treonin kinaz Checkpoint kinaz 2 (CHK2), üç fonksiyonel alandan oluşan bir tümör baskılayıcı proteindir; SQ/TQ tekrar bölgesi (20-75), çatalbaşıyla ilişkili (FHA) bölge (112-175) ve bir serin/treonin kinaz bölgesi (225-490). N terminalinin yakınında bulunan SQ/TQ tekrar bölgesi, çift sarmallı bir DNA kırılmasından sonra CHK2'yi etkinleştiren ataksi-telanjiektazi-mutasyona uğramış protein (ATM) gibi CHK2'yi etkinleştiren proteinler için bir hedeftir. FHA bölgesi, aktivasyon üzerine proteinin genel yapısını düzenler ve CHK2'nin diğer fosforile proteinlere bağlanmasında rol oynar. Proteinin C-terminal yarısı, diğer serin/treonin kinazlarla yapısal ve ardışık benzerliklere sahip olan kinaz bölgesinden oluşur. DNA'da bir çift sarmal kırılmasının tanınması üzerine, ATM, duyusal proteinler tarafından fosforile edilir ve aktive edilir. Aktive edilmiş ATM daha sonra CHK2'yi 68. pozisyonda treonin üzerinde fosforile eder. Bu, inaktif CHK2 monomerlerinin dimerizasyonuna ve oto-inhibitör döngü üzerindeki treonin kalıntıları 383 ve 387 ve kinaz alanı üzerindeki serin kalıntısı 516 üzerinde trans-otofosforilasyona neden olur. Aktive edilmiş CHK2 daha sonra hücre döngüsü gecikmesi, DNA onarım mekanizması ve apoptoz mekanizması ile ilgili yolları aktive ederek sinyali iletir. CHK2'nin bilinen hedefleri, hücre döngüsü kontrolü için CDC25C ve CDC25A, Plk3 kinaz, E2F1 transkripsiyon faktörü; DNA onarımı için BRCA1; ve hücre ölümünün düzenlenmesi için p53'tür. CHEK2 geninin bazı varyantlarının kanser riskini arttırdığı bilinmektedir. CHEK2 genindeki bazı mutasyonların Li-Fraumeni gibi kansere neden olduğu bilinen sendromlara yol açtığı bilinmektedir. CHEK2'nin yanlış anlamlı mutasyonları, erkek taşıyıcılarda non-Hodgkin lenfoma ve prostat kanseri ile de ilişkilidir. CHEK2'nin en tekrarlayan patojenik varyantlarından biri 1100delC'dir ve birçok çalışma bu delesyon mutasyonunun kanser riskini artırdığını göstermiştir. İlk olarak 1100delC, Li-Fraumeni ve Cowden sendromları ile ilişkilidir. Farklı etnik gruplardaki meme kanseri hastalarında 1100del sıklığının daha düşük olduğunu gösteren çalışmalar vardır, ancak Amerikan ve Rus popülasyonlarında 1100delC daha yüksek meme kanseri riski ile ilişkilidir. İkinci en önemli patojenik mutasyon, 157. pozisyonda (I157T) izolösinin treonine dönüşmesidir. I157T'nin forkhead ile ilişkili alanda etkileşime neden olduğu ve azalan dimerizasyon nedeniyle bozulmuş aktiviteye neden olduğu bilinmektedir. Başka bir zararlı CHEK2 mutasyonu da mevcutsa, I157T taşıyıcılarında kanser gelişme riski artar. Klinik önemi bilinmeyen (VUS) çok sayıda varyasyon, tipik olarak, birden fazla gen kanser duyarlılığı için tarandığında bulunur. Kanserle ilgili genler arasında, patojenik varyantlar meme, kolon, prostat, tiroid ve böbrek dahil olmak üzere çeşitli kanser türleri ile ilişkili olduğundan CHEK2 VUS'ları özellikle ilgi çekicidir. Akçay ve meslektaşları tarafından 2020 yılında yapılan bir çalışmada, meme ve kolorektal kanser hastalarında ve yaşlı kontrollerde varyant dağılımının saptanması için Türk popülasyonunda 25 kansere yatkınlık geni taranmaktadır. Çalışma, Türk meme kanseri hastalarında CHEK2 geninin en fazla VUS taşıyan gen olduğunu ortaya koydu. Türk meme kanseri hastalarında bulunan CHEK2 geninin VUS'larını sınıflandırmak için mutant proteinlerin yapısal ve fonksiyonel etkilerinin karakterize edilmesi gerekmektedir. Bu çalışmanın ilk adımı olarak da yabanıl tip proteinin üretimi ve saflaştırması optimize edilmelidir. Bu çalışmanın amacı, E. coli'de rekombinant vahşi tip CHK2 proteini üretmektir. Öncelikle gen, 6XHis ve 3xFLAG etiketi ile ifade vektörü pET30a'ya klonlandı. Proteini üretmek için E. coli suşu BL21 seçildi ve üretim optimize edildi. IPTG ile indüksiyondan sonra inkübasyon sıcaklığı olarak 17 °C seçildi. Hücre parçalanması sonrasında çözünür fraksiyon, immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) ile CHK2'yi saflaştırmak için kullanıldı. Saflaştırma optimize edildikten sonra, uzak UV ölçümü yoluyla proteinin ikincil yapısını belirlemek için dairesel dikroizm spektroskopisi kullanıldı.6XHis etiketi ile 3XFLAG etiketi arasında, TEV enzim kesiminden sonra ikinci bir IMAC aracılığıyla kirlilikleri ortadan kaldırmak için TEV enzimi kesme bölgesi eklenmiştir. Ancak bu kullanılmadı çünkü protein nispeten saftı ve kirleticilerin çoğu parçalanmış CHK2 proteininden geliyordu. Vahşi tip proteinin ikincil yapısı, saflaştırılmış proteinlerin CD eğrisi alfa sarmal proteinle eşleştiği için doğru şekilde katlandığını ortaya çıkardı.

Özet (Çeviri)

This thesis is composed of two distinct subjects separated by two chapters. The first chapter focuses on the“Production, purification, and pegylation of G-CSF”. The granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) is a cytokine and has a role in the maturation, differentiation, and migration of white blood cells. The G-CSF protein is an 18-kDa protein and has a theoretical pI of 5.6. 5 cysteine residues form 2 disulfide bonds and one free cysteine locates at the 18th position. White blood cells are one of the major systems used against pathogens. The absence or low abundance of white blood cells results in a condition called neutropenia. Neutropenia patients require admission of G-CSF in its drug form, which is called filgrastim. Filgrastim is a recombinant therapeutic protein, and due to its low molecular weight, its elimination through the kidneys causes a short half-life in blood circulation. To solve the short half-life problem, a chemically modified form of G-CSF has been created. The N-terminus of the protein is modified with a 20 kDa polyethylene glycol (PEG) that increases the molecular weight by two-fold. The chemical addition of a PEG molecule is called pegylation, and several types of pegylation vary in terms of the molecular weight or the structure of PEG, or the target of the pegylation. The Food and Drug Administration (FDA) approved N-terminus pegylated filgrastim, which is called Pegfilgrastim and it is the first FDA-approved pegylated drug. To add the PEG to the N-terminus, the methoxy-PEG aldehyde and the chemical reaction called reductive amination are terminated with the addition of a reducing agent. The common pegylation method involves the addition of a reducing agent, sodium cyanoborohydride that forms the toxic cyanide as a byproduct. This study aims to find a high-yield protein production strategy from bacterial cells and to find an alternative to sodium borohydride. First of all, to increase the yield of protein production in E. coli BL21, the existing method in our lab was optimized. The protein is produced under the Lac operon promoter and the production is induced with IPTG. At 37 °C, the protein is produced at the inclusion body and needs to be solubilized and refolded. 8 M urea seems to be inefficient to solubilize the protein, therefore an alkali buffer was also tried and compared to the former method. Then, the bacteria incubated at 17 °C produced the protein in soluble form. That method of soluble protein production has been tried. To overcome the instability, the 18th cysteine was substituted to a serine residue with site-directed mutagenesis. Even though the alkali buffer has a higher yield of solubilization, the process is not suitable overall due to the instability of the G-CSF at pH values over 5.5. The soluble protein method was inconvenient, as this method yields more impurities in the elution. The mutation increased the stability of the protein in the dialysis steps; however, it was not enough to produce the protein with a higher yield. The second part was about pegylation of G-CSF. The substitution of sodium cyanoborohydride with sodium borohydride was not successful, as the latter is not stable in aqueous solutions. As the optimized method was not suitable to produce G-CSF in an industrial scale, other methods such as adding a solubilizing tag or a tag to help purification which also increases the size of the protein can contribute to increasing the half-life and also the purification of the protein. Also, this thesis contributed to the literature by the trial of Sodium borohydride as a reducing agent in pegylation reaction and showed the inefficiency of the chemical due to its instability. The second chapter of the thesis is about the“Characterization of CHEK2 VUSes found in genetic screening of Turkish breast cancer patients”. The CHEK2 gene is a tumor suppressor and encodes the protein serine-threonine kinase Checkpoint kinase 2 (CHK2). CHK2 protein consists of three functional domains; SQ/TQ cluster domain (SCD), forkhead-associated (FHA) domain, and the kinase domain. The SCD is a target for CHK2 activator proteins. The FHA domain has a role in the dimerization and activation of the CHK2 monomers by trans-activation through further phosphorylation. The kinase domain is where CHK2 binds to its downstream targets and phosphorylates them. CHK2 is involved in a double-strand DNA break repair mechanism. Firstly, ATM is activated by double-strand break recognition proteins, and it phosphorylates CHK2 at the 68th threonine. CHK2 then phosphorylates and activates the pathways of cell cycle delay, DNA repair, and apoptosis. There are variants of CHEK2 that cause non-functional proteins and are therefore related to Li-Fraumeni syndrome or several cancer types. The pathogenic variants of CHEK2 are known to be associated with breast, colon, kidney, and prostate cancers. However, some variants are not identified as either pathogenic or benign. These variants are called Variants of Unknown Significance (VUS). In the previous study, Akcay and colleagues found that CHEK2 is the most VUS-carrying gene among 25 other cancer-related genes in Turkish breast cancer patients. To be able to classify the variants of unknown significance in vitro, the optimization of CHKk2 production should be performed. This study aimed to produce and purify recombinant wild-type and mutant CHK2 proteins in E. coli. First of all, the gene is cloned into the expression vector pET30a with 6xHis and 3xFLAG tags. The E. coli strain BL21 was chosen to produce the protein, and the production is optimized. 17 °C was selected as the incubation temperature after induction with IPTG. The soluble fraction after lysis is used to purify CHK2 with immobilized metal affinity chromatography (IMAC). After the purification is optimized, circular dichroism spectroscopy is used to identify the secondary structure of the protein via far-UV measurement. Between the 6xHis tag and the 3xFLAG tag, the TEV enzyme restriction site was additionally provided to eliminate contaminants via a second IMAC after TEV digestion. However, this was not used because the protein is relatively pure and the majority of the contaminants come from cleaved CHK2 protein. The secondary structure of the wild-type and mutant proteins revealed that the purified protein was correctly folded as the CD curve matches an alpha-helical protein. The in vitro studies using the recombinant CHK2 may resolve the effect of the mutations on structure and function of the protein.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    474878

    Granulocyte-colony stimulating factor analog production by recombinant Escherichia coli

    Rekombinant Escherichia coli ile granülosit-koloni uyarıcı faktör analogu üretimi

    ONUR ERSOY

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. HASAN ONGUN ONARAN

  2. Tez No

    558728

    Hematopoetik hücrelerin üretilmesi, çoğaltılması ve farklılaşmasında görevli epo ve tpo'nun medikal biyoteknolojik ürün olarak üretilmesi, saflaştırılması ve karakterizasyonu

    Production, propagation and differentiation of hematopoetic cells producing, purification and characterization of epo and tpo as medical biotechnological product

    DUYGU DÜZGÜN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    BiyomühendislikTokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ SEÇİL ERDEN TAYHAN

  3. Tez No

    595574

    Receptor-targeted carbon nanotubes as nanomaterials for diagnostics and targeted treatment of cancer

    Kanser teşhis ve tedavisi için reseptör-hedefli karbon nanotüp nanomalzemelerin geliştirilmesi

    MEHDI PARTOVI MERAN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    Kimya Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. FATMA SENİHA GÜNER

  4. Tez No

    323748

    Evaluation of cationic polymer vectors for non-viral gene delivery

    Katyonik polimerlerin gen taşıyıcı sistemler olarak değerlendirilmesi

    HATİCE İMRAN GÜNGÖRDÜ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2012

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GÜLAÇTI TOPÇU

  5. Tez No

    861908

    Mevalonat kinaz eksikliği olan hastalarda t-hücre alt tiplerinin incelenmesi

    Investigation of t-cell subtypes in patients with mevalonate kinase deficiency

    BÜŞRA ŞENİZ DEMİR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    Tıbbi BiyolojiErciyes Üniversitesi

    Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AHMET EKEN

Geri Dön