Pamuk bitkisinden izole edilen nikotinamid adenin dinükleotid bağımlı format dehidrogenazın stabilitesinin arttırılması
Increasing stability of nicotinamide adenine dinucleotide dependent format dehydrogenase isolated from cotton plant
- Tez No: 635744
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ EMEL ORDU
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Genetik, Biology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2020
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Yıldız Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 76
Özet
NAD+ bağımlı format dehidrogenazlar (FDH, EC 1.2.1.2), kiral moleküllerin sentezi için kullanılan ve pahalı bir koenzim olan NAD(P)H' nin yenilenmesi için özellikle farmasötik endüstrisinde önemli enzimlerdir. Bununla birlikte, FDH enzimleri, stabilite yetersizliği nedeniyle, biyotransformasyon koşulları altında hızlı bir aktivite kaybı göstermektedir. Enzim stabilitesi, endüstriyel biyotransformasyon işlemlerinin gelişimi için sınırlayıcı bir faktördür. Biyotik ve abiyotik stres koşullarında bitki büyümesi üzerindeki etkileriyle ilgili çok sayıda veri bulunmasına rağmen, bitki kaynaklı rekombinant FDH' lerin stabilitesi konusundaki bilgimiz sınırlıdır. Bu durum bitki kaynaklı FDH' lerin biyoteknolojik potansiyelinin değerlendirilmesini de kısıtlamaktadır. Bu nedenle, çalışmamızda Gossypium hirsutum' dan izole edilen NAD+ bağımlı FDH' nin (GhFDH) stabilitesini geliştirmek amacıyla bölgeye yönelik mutagenez yöntemi kullanılmıştır. GhFDH yapısında bulunan 3 metiyonin amino asidi oksidatif strese dayanıklı lösin amino asidi ile yer değiştirilerek bu değişimlerin enzimin katalitik özelliklerine ve stabilitesine olan etkisi araştırılmıştır. Metiyonin-lösin değişimi için rekombinant GhFDH enziminin M258, M294 ve M299 konumları seçilmiştir. Mutant GhFDH proteinlerin homoloji modellerinin yapılmasının ardından aktivite ve stabilite deneyleri yapılarak bu mutasyonların protein aktivitesi ve stabilitesi üzerindeki etkileri değerlendirilmiştir. M294L ve M299L mutant enzimlerinin aktivite göstermeme nedeninin bu konumlardaki metiyonin amino asitlerinin katalitik aktivite için önemli olan amino asitler ile kritik etkileşim içinde olduklarını ve bu nedenle enzimin katalitik aktivitesinin kaybına sebebiyet verdiklerini düşündürmektedir. M258L mutantının katalitik aktivitesi (kcat / Km) yabanıl GhFDH' e kıyasla 0.39 s-1 mM-1' dan 0.29 s-1 mM-1' a düşmüştür. Stabilite deneyleri sonucu M258L mutasyonunun termal stabilitede 6 0C' lik bir düşüşe neden olduğunu göstermektedir. Oksidatif stabilite deneyleri sonucunda ise 50 mM H2O2' de yabanıl tip GhFDH' e göre önemli bir fark göstermese de, 100 mM' lık H2O2 ' a maruz bırakılan M258L mutantının yabanıl GhFDH den 2 kat daha fazla süre aktivitesini koruduğu tespit edilmiştir. Oksidatif stabilitesinde görülen bu sonuç M258L mutantının geliştirilmek için umut vaad edici olduğunu ortaya koymaktadır. Çoklu mutasyonlar ve CD ölçümleri ile yapısal analizler yapılarak mutasyonların enzimin aktivite ve stabilitesine olan etkisi incelenmelidir.
Özet (Çeviri)
The NAD+-dependent formate dehydrogenases (FDH, EC 1.2.1.2) are important enzymes especially in pharmaceutical industry for the regeneration of NAD(P)H which is an expensive coenzyme used for chiral molecules synthesis. However, FDH enzymes show a rapid loss of activity under biotransformation conditions because of the lack of thermostability. Enzyme stability is a limiting factor for the development of industrial biotransformation processes. While there is a wealth of data for the effects on plant growth under biotic and abiotic stress conditions, our knowledge about stability of plant-derived recombinant FDHs is limited. This also restricts the evaluation of the biotechnological potential of plant-sourced FDHs. Therefore, in our study, we used site directed mutagenesis method to improve the stability of NAD+-dependent FDH isolated from Gossypium hirsutum (GhFDH). The effect of these changes on the catalytic properties and stability of the enzyme was investigated by replacing the 3 methionine amino acid in the GhFDH structure with the oxidative stress-resistant leucine amino acid. M258, M294 and M299 residues of the recombinant GhFDH enzyme were selected for the methionine-leucine exchange. After making homology models of mutant GhFDH proteins, activity and stability experiments were performed and the effects of these mutations on protein activity and stability were evaluated. The reason why M294L and M299L mutant enzymes do not show activity is that methionine amino acids in these locations are in critical interaction with amino acids that are important for catalytic activity and thus cause loss of catalytic activity of the enzyme. The catalytic activity (kcat / Km) of the M258L mutant decreased from 0.39 s-1 mM-1 to 0.29 s-1 mM-1 compared to wild GhFDH. The stability experiments show that the M258L mutation causes a 6 ° C decrease in thermal stability. As a result of the oxidative stability experiments, it was determined that the M258L mutant exposed to 100 mM H2O2 retains its activity 2 times more than the wild GhFDH, although it does not show a significant difference compared to wild type GhFDH at 50 mM H2O2. This result, seen in its oxidative stability, reveals that the M258L mutant is promising for development. The effect of mutations on the activity and stability of the enzyme should be examined by performing structural analysis with multiple mutations and CD measurements.
Benzer Tezler
- Pamuklarda Verticillum solgunluğu (Verticillium dahliae kleb.)'na karşı endofitik bakterilerle biyolojik mücadele olanakları
Bioligical control options of Verticillium wilt (Verticillium dahliae kleb.) of cotton by endophytic bacteria
NALAN ÇUBUKCU
Yüksek Lisans
Türkçe
2007
ZiraatAdnan Menderes ÜniversitesiBitki Koruma Ana Bilim Dalı
PROF.DR. KEMAL BENLİOĞLU
- İnsan yumurtalık kanseri hücre hattında (Ovcar-3) zoledronik asit ve Gossypol'un sitotoksik ve apoptotik etkilerinin araştırılması
An investigation of cytotoxic and apoptotic effect of zoledronic acid and Gossypol in ovarian cancer cell line (OVCAR-3)
HARİKA ATMACA
Yüksek Lisans
Türkçe
2008
BiyolojiCelal Bayar ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. SELİM UZUNOĞLU
- Bamya bitkisinden izole edilen tohum ve toprak kökenli fungal hastalık etmenlerine karşı antagonist bakterilerin in vitro biyokontrol etkinliklerinin belirlenmesi
Determination of in vitro biocontrol efficacies of antagonist bacteria against some seed and soil borne fungal disease agents on okra plant
GİZEM ATAKAN TANGÜL
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
ZiraatHatay Mustafa Kemal ÜniversitesiBitki Koruma Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SONER SOYLU
- GbVe geninin allelik varyasyonu ve pamuk (Gossypium barbadense L.) bitkisinden izolasyonu
Allelic variation of gbve gene homolog and its isolation from cotton (Gossypium barbadense L.)
AYSEL ÖZGÜL ŞİŞMAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2013
ZiraatKahramanmaraş Sütçü İmam ÜniversitesiBiyomühendislik ve Bilimleri Ana Bilim Dalı
PROF. DR. YÜKSEL BÖLEK
- Pamuk solgunluk hastalık etmeni Verticillium dahliae'da belirlenen mikoviral dsRNA'nın tanılanması ve virülenslik etkisinin belirlenmesi
Identification of dsRNA mycoviruses in Verticillium wilt agent and effect of virulence on cotton
FATMA SELİN TÜREMEN
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
ZiraatAydın Adnan Menderes ÜniversitesiBitki Koruma Bilim Dalı
PROF. DR. SERAP AÇIKGÖZ