The regulation of the CXXC5 gene expression
CXXC5 gen ekspresyonunun düzenlenmesi
- Tez No: 657654
- Danışmanlar: PROF. DR. MESUT MUYAN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoloji, Genetik, Biology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2021
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 106
Özet
Vücutta dolaşımda bulunan ana östojen hormonu 17β-estradiol (E2)'dur ve başta meme dokusu fonksiyonları olmak üzere, farklı dokuların fizyolojik ya da patofizyolojik durumlardaki düzenlenmesinde görev alır. E2 hedef dokularındaki, hücresel çoğalma, farklılaşma ve/veya ölüm görevlerinden sorumludur. Önceki mikrodizin çalışmalarımız, CXXC5 ifadesinin E2-ERα ile düzenlendiğini ve bunun ERE-bağımlı sinyal yolağı üzerinden gerçekleştiğini önermekteydi ve biz de CXXC5 transkript seviyelerinin E2'ye yanıtla arttığını doğruladık. CXXC5 bir ZF-CXXC5 domain protein ailesi üyesi olarak yüksekçe korunmuş olan CXXC domaini ve nükleer lokalizasyon sinyali içermektedir. Fonksiyonel olarak karakterize edilmiş olan ZF-CXXC protein ailesi üyeleri, CXXC domainleri aracılığyla; tercihen transkripsiyonel olarak aktif olan DNA bölgelerindeki CpG adalarının, metile-olmamış CpG dinükleotitlerine bağlanmaktadırlar; biz de CXXC5'in de metile-olmamış CpG dinükleotitlere bağlanan bir protein olduğunu gösterdik. Bu bağlanma sayesinde sitozin metilasyonu engellenerek, tranksripsiyon düzenlenmesinde görev alan histon modifiye edici proteinlerin getirilmesi için, doğrudan ya da dolaylı olarak kullanılan bir çekirdeklenme alanı oluşturulur. CXXC5 ile ilgili yapılmış olan kısıtlı çalışmaya göre CXXC5; farklı sinyallere yanıtla, epigenetik düzenleyici ve/veya eş-düzenleyici olarak görev almaktadır. Ancak CXXC5 geninin ekspresyonunun nasıl sağlandığı ile ilgili mekanizmalar hala bilinmemektedir. Doktora çalışmalarımda, CXXC5 proteininin sentezlenmesinin tıpkı CXXC5 ifadesinde olduğu gibi E2-yanıtlı ve ERα bağımlı olduğunu gösterdim. CXXC5 lokusunda yer alan bir de novo ERE buldum ve ERα'nın hem in vitro hem de in cellula olarak bu ERE'ye bağlandığını gösterdim. Buna ek olarak, reportör enzim tahlilleri kullanarak, E2-ERα kompleksinin bu ERE'ye bağlanmasının fonksiyonel olduğunu ve trankripsiyonel bir aktivasyon sağladığını bulguladım. Sonrasında bu distal olarak konumlanmış olan ERE'nin CXXC5 ifadesinin düzenlenmesine nasıl katkıda bulunduğunu anlayabilmek için CXXC5 promotörünü bulgulamak üzere çalışmalarıma devam ettim. CXXC5'in tanımlanmış olan 14 transkript varyantı olduğundan, model hücre hattımız olan MCF7'lerde hangi CXXC5 varyant(lar)ının daha çok bulunduğunun tespit edilmesinin CXXC5 promoter çalışmaları için gerekli olduğuna karar verdim. Bu sebeple ana CXXC5 varyatını (CXXC5-TV2) tespit ettikten sonra, öz promotör elemanları genellikle transkripsiyon başlangıç noktaları (TSSs) civarında yer almakta olduğu için; bu varyanta yönelik olarak 5'Rapid Amplification of cDNA Ends (5'RACE, cDNA sonlarının hızlı olarak çoğaltılması) yaklaşımını kullanarak transkripsiyon başlangıç noktalarını belirledim. Sonrasında lusiferaz raportör tahlilleri kullanarak CXXC5 öz promotör elemanlarının yerini saptadım. CXXC5 promotörünün CXXC5-TV2'nin ilk eksonu içinde yer aldığını ve CXXC5'in bir CGI promotör (CpG Island Promoter, CpG Adacık Promotör) tarafından düzenlendiğini bulguladım. Promotör bölgesini tespit ettikten sonra, CXXC5 promotörü ile etkileşime geçen proteinleri tespit edebilmek amacıyla promotör çöktürme çalışmaları gerçekleştirdim. Sıvı kromatografisi-ardışık kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ile tespit edilen proteinlerden, ELF1 (E74 Like ETS Transcription Factor 1), MAZ (Myc-associated zinc finger protein), and RB1 (Retinoblastoma-associated protein) proteinlerinin CXXC5 promotörüne in vitro ve in cellula olarak bağlandığını gösterdim. Ayrıca CXXC5 promotörü içerisinde; ELF1 ve MAZ transkripsiyon faktörlerinin bağlanma motif sekanslarının yerini tespit ettim. Buna ek olarak, ELF1 ve MAZ proteinlerinin CXXC5 ekspresyonunun düzenlenmesine dahil olduklarını arttırma (overexpression) ve azaltma (knocking-down) çalışmaları ile gösterdim. CXXC5 ekspresyonunun ve buna bağlı olarak protein sentezinin, E2-ERα sinyali tarafından, intronik bir bölgede yer alan ERE üzerinden düzenlendiğini gösterdim. CXXC5 promotör bölgesini bulguladım ve promotör ile etkileşime geçen birkaç transkripsiyon faktörünü göstererek, bunların CXXC5 ifadesinin düzenlenmesine dahil olduklarını tespit ettim. Tezimde gösterdiğim bulgular, E2-yanıtlı olan CXXC5 geninin nasıl düzenlendiğinin anlaşılabilmesi için bir temel oluşturacaktır. Buna bağlı olarak da E2-ER sinyal yolağının fizyolojik ve patofizyolojik koşullardaki aksiyonlarının daha iyi anlaşılmasını sağlayabilecektir.
Özet (Çeviri)
17β-estradiol (E2) is the main circulating estrogen hormone in the body and is involved in the physiological and pathophysiological regulation of various tissue notably mammary tissue functions. E2 is responsible for cellular proliferation, differentiation, and/or death in target tissues. Our previous microarray studies suggested that expression of CXXC5 is regulated by E2-ERα through ERE-dependent signaling pathway and I verified that the CXXC5 transcript levels are augmented in response to E2. As a member of the ZF-CXXC domain protein family, CXXC5 harbors a highly conserved CXXC domain and nuclear localization signal. It is known that functionally characterized ZF-CXXC domain protein family members bind to preferentially non-methylated CpG dinucleotides in CpG islands of transcriptionally active DNA regions via their CXXC domains, and we showed that CXXC5 also binds to non-methylated CpG dinucleotides. Cytosine methylation is prevented due to this binding, and a nucleation site formation is induced for the direct/indirect recruitment of transcription co-regulators, histone-modifying proteins, which leads to the regulation of transcription. According to the limited studies on CXXC5, it appears to be that CXXC5 participates in the cellular events as an epigenetic regulator and/or co-modulator in response to various signaling pathways. However, the mechanisms of how the CXXC5 gene expression is mediated remain unknown. In my doctoral studies, I showed the expression and the synthesis of CXXC5 is E2- and ERα-dependent. I found that an intronic ERE sequence in the CXXC5 locus, and I showed that this de novo ERE is bound by ERα in vitro and in cellula. In addition, I showed that the binding of the E2-ERα complex is functional and resulted in the transcriptional activation using reporter enzyme assays. To understand how this distally located ERE participates in the regulation of CXXC5 expression regulation; first I wanted to identify the CXXC5 promoter. Since there are 14 annotated transcript variants for CXXC5, I foresaw that the identification of the main CXXC5 variant(s) expressed at the highest amount in MCF7 cells as our cell model is necessary for the promoter analyses studies. Therefore, after the identification of the primary CXXC5 transcript (CXXC5-TV2), I conducted 5'Rapid Amplification of cDNA Ends (5'RACE) studies to uncover the transcription start site(s) (TSSs) of the CXXC5-TV2 to characterize the core promoter elements which are generally found in proximity to the TSSs. Next, I performed luciferase reporter assays to locate the core promoter elements of the CXXC5. I showed that the CXXC5 promoter region resides within the first exon of the CXXC5-TV2, and the expression of CXXC5 is driven by a CGI promoter (CpG Island Promoter). After identifying the promoter region, I continued with promoter pull-down studies to characterize the putative CXXC5 promoter interactor proteins. Of the identified proteins by Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), I validated the binding of the ELF1 (E74 Like ETS Transcription Factor 1), MAZ (Myc-associated zinc finger protein), and RB1 (Retinoblastoma-associated protein) to the CXXC5 promoter. I also found the sequence motifs for DNA binding of ELF1 and MAZ in the CXXC5 promoter. I verified that ELF1 and MAZ contribute to the regulation of CXXC5 expression using endogenous and heterologous gene expression approaches. In summary, I found that the expression, and consequently, the synthesis of CXXC5 are regulated by E2-ERα signaling through an intronic ERE. I located the CXXC5 promoter region and identified the several transcription factors engaged with the promoter, and verify that these transcription factors are involved in the gene expression regulation of CXXC5. The findings presented in this dissertation could provide a basis for understanding the regulation of an E2-responsive gene CXXC5, therefore, could provide a better understanding of the E2-ER signaling actions in physiological and/or pathophysiological conditions.
Benzer Tezler
- Initial characterization of CXXC5 as a putative DNA binding protein
Potensiyel olarak DNA'ya bağlanan CXXC5 proteininin ön karakterizasyonu
PELİN YAŞAR
Yüksek Lisans
İngilizce
2015
BiyolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MESUT MUYAN
- Epigenetic characterization of CXXC5 gene locus
CXXC5 gen lokusunun epigenetik karakterizasyonu
GİZEM KARS
Yüksek Lisans
İngilizce
2018
BiyolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MESUT MUYAN
- Establishment of cell lines with inducible expression of shRNA for an estrogen responsive gene
Östrojen duyarlı bir genin indüklenebilir shRNA ifadesi olan hücre hatlarının oluşturulması
BURCU KARAKAYA
Yüksek Lisans
İngilizce
2018
BiyolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MESUT MUYAN
- Structural and functional characterization of the CXXC-type zinc finger protein 5 (CXXC5)
CXXC-tipi çinko parmak 5 proteinin (CXXC5) yapısal ve fonksiyonel karakterizasyonu
GAMZE AYAZ ŞEN
Doktora
İngilizce
2018
BiyokimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MESUT MUYAN
- Functional importance of CXXC5 in E2-driven cellular proliferation
CXXC5'in E2 tarafından düzenlenen hücre proliferasyonundaki fonksiyonel önemi
NEGIN RAZIZADEH
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
BiyolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MESUT MUYAN