Geri Dön

Aptamer selection against cadaverine/lysine antiporter (CADB) purified in mild detergent

Hafif deterjanda saflaştırılmış kadaverin/lösin antiportu (CADB) için aptamer seçilimi

PDF İndir

  1. Tez No: 662050
  2. Yazar: NİLÜFER KARA
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ DEVRİM SON, DR. MÜSLÜM İLGÜ
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyokimya, Biochemistry
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2021
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyokimya Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 151

Özet

Membran Proteinlerinin (MP) hedef molekülü olarak kullanımı, sahip oldukları amfipatik doğaları nedeniyle zordur. MP'lerin çift katlı lipit tabakasında bulunan hidrofilik ve hidrofobik kısımları, MP'lere karakteristik işlevlerini kazandırır. Bu sebeple, in vitro çalışmalarda, MP'lerin doğru bir şekilde işlevlerini yerine getirebilmeleri için protein katlanmasını sağlamak adına doğal çevrelerini taklit edebilecek bir ortama gereksinim duyulmaktadır. Bu noktada, deterjan ile muamele MP'lerinin işlevlerini yitirmeden çözünmesi ve stabil bir protein olarak kalması açısından çok önemlidir. Biz çalışmalarımızda, aptamer seçilimi için, Escherichia Coli'nin iç membranında yer alıp, ikincil bir antiport olan ve aynı zamanda asidik stres adaptasyonunda önemli rol oynayan Kadaverin/Lösin Antiportu (CadB) proteinini MP'lerine bir model olarak hedefledik. Aptamerler, in vitro olarak seçilen DNA ya da RNA oligonükleotitlerinden oluşan kısa nükleik asit zincirleridir. Aptamerlerin seçilimi, Üstel Zenginleştirme ile Ligandların Sistematik Evrimi (SELEX) yöntemi ile gerçekleştirilir. Bu süreç, yüksek afinite ve seçilimle hedef molekülüne bağlanan aptamer/leri seçmek için tekrarlayan turlarla oluşmakta olup üç ana adımda bir tur tamamlanmaktadır: hedef molekülü ile inkübasyon, oligo-bağlı protein yapılarının ayrılması, oligo çoğaltma. Hedef molekülü ile etkileşim, aptamerin yapısında konformasyonel bir değişiklik meydana getirir. Aptamer geliştirildikten sonra, bu etkileşim, ileriki çalışmalarda tedavi ve teşhis alanlarında potansiyel kullanıma sahiptir. Şimdiye dek, aptamer seçiliminde pek çok SELEX tekniği kullanılmıştır. Fakat bunlardan bazıları iş gücü gerektiren, zaman alıcı ve MP'lere karşı özgüllüğü düşük olan yöntemlerdir. Bu projede, seçilimi gerçekleştirmeden önce, CadB'nin çözünürlüğünü ve saflaştırılmasını hafif bir deterjan olan n-dodesil-β-D-maltopiranosit (DDM)'te gerçekleştirdik. Son tur tamamlandıktan sonra, RNA havuzu sekanslaması yapıldı ve son olarak 29 farklı sekans elde ettik. En çok tekrarlanan sekansları (iki kez tekrarlanmış şekilde) belirledik: CadB30, CadB35 ve CadB39. Sonrasında, çoklu sekans hizalama analizi ile potansiyel bağlanma motifini bulduk. Sonra, tahmini ikincil yapılara (RNAfold ve KineFold tarafından yapıldı) göre, bu motif CadB35 ve CadB39'un ilmik (loop) yapısında bulunurken, CadB30'un sap (stem) yapısında bulundu. Ayrıca, biz bunların yapısal benzerliklerini homoloji matriksleriyle göstermek için, CadB30 ve CadB39'a yakın olacak şekilde rastgele bir proto-aptamer (CadB41) seçtik. Biz bu çalışmada, sekiz tur protein-SELEX'inden sonra CadB'ye karşı aptamerleri başarıyla elde ettik. Bu çalışma, CadB bir MP olarak, uygun bir deterjanda protein-SELEX ile hedef molekülü olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Bu şekilde, yakın gelecekte teşhis ve tedavi amaçlarında, MP'lerin hedef molekülü olarak kullanımı daha elverişli hale gelecektir. Protein-SELEX, bütün proteinler için uygun olduğundan daha basit, zaman kazandıran, uygun maliyetli aptamer seçilimi sağlar.

Özet (Çeviri)

Membrane Protein (MP) targeting remains a challenge because of their amphipathic nature. In the lipid bilayer, both hydrophobic and hydrophilic domains provide MPs their characteristic functions. Therefore in vitro studies require an environment for mimicking their natural membrane environment in order for MPs to fold into their native conformation to function properly. Here, treatment with a detergent is imperative for a MP solubilization to make it a stable individual protein without losing its functionality. In our studies, for aptamer selection we targeted Cadaverine/Lysine Antiporter (CadB) as a model protein for MPs, a secondary transporter on the inner membrane of Escherichia Coli with a critical role in acid stress adaptation. Aptamers are short in vitro-selected RNA or DNA oligonucleotides. The selection of aptamer is engineered by the method known as Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment (SELEX). This process has iterative rounds to select the best aptamer/s with high affinity and selectivity for a given target. It consists of three main steps: incubation of the aptamer with the target, separation of bound oligo-protein complex, and oligo amplification. Interactions with the target lead to conformational change on the aptamer structure. After aptamer development, these interactions may find potential uses in diagnostic or therapeutic applications. To date, many kinds of SELEX techniques have been carried out for aptamer selection. However, some are labor- and time- consuming and may give less specificity against MPs. In this project, before selection, we achieved both solubilization and purification of CadB in a mild detergent, n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM). We performed eight rounds of protein-SELEX against CadB in DDM. After completing the final round, the RNA pool was sequenced, and we finally got 29 distinct sequences. We found three abundant sequences with double copies: CadB30, CadB35, and CadB39. Furthermore, we determined the potential binding motif by multiple sequence alignment analysis. After that, according to the predicted 2D secondary structures (done by RNAfold and KineFold), this motif was found on the loops of CadB35 and CadB39, while it was found on the stem of CadB30. Also, we randomly chose a proto-aptamer (CadB41), which is closed to CadB30 and CadB39, to show their structural similarity with their homology matrixes. Overall, in this study, we successfully generated aptamers against CadB after eight rounds of protein-SELEX. This study shows that CadB, as an MP, can be targeted by protein-SELEX in a suitable mild detergent. In this way, targeting MPs may become more convenient for both diagnosis and therapeutic purposes in the near future. Protein-SELEX is suitable for all kinds of proteins, and it serves as an efficient, straightforward, time-saving, and cost-effective way for aptamer selection.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    798765

    İmplant kaynaklı enfeksiyon etkeni olan staphylococcus epidermidis'e özgü aptamer geliştirilmesi ve aptamerin biyofilm oluşumuna etkisinin in vitro koşullarda incelenmesi

    Development of specific aptamer for staphylococcus epidermidis which causes implant related infections and in vitro investigation of aptamer's effect on biofilm formation

    EMİNE ALTUN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    BiyomühendislikHacettepe Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HÜLYA YAVUZ ERSAN

    DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR

  2. Tez No

    829424

    Rekombinant interlökin-6 (IL-6) üretimi ve interlökin-6 hedefli aptamer seçimi

    Recombinant production of interleukin-6 (IL-6) and selection of aptamer targeting interleukin-6

    HAKAN SOYTÜRK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    BiyokimyaEge Üniversitesi

    Biyokimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SERAP EVRAN

    PROF. DR. MEHMET İNAN

  3. Tez No

    675776

    Büyüme hormonu salgılatıcı hormona [GHRH (1-44)] özgü X-aptamerlerin sentezlenmesi, karakterizasyonu ve anti-karsinojenik etkilerinin araştırılması

    Synthesis, characterisation and investigation of anti-carcinogenic effects of x-aptamers against growth hormone releasing hormone [GHRH (1-44)]

    BURCU AYHAN ŞAHİN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    Biyolojiİstanbul Kültür Üniversitesi

    Moleküler Biyokimya ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AJDA ÇOKER GÜRKAN

  4. Tez No

    511668

    İnvazif enfeksiyonlara neden olan genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz (GSBL) oluşturan Enterobacteriaceae izolatlarının hızlı teşhisi için DNA aptamerlerinin geliştirilmesi

    Development of DNA aptamers for rapid diagnosis of extensive spectrum beta-lactamase (ESBL) producing Enterobacteriaceae isolates which causes invasive infections

    HATİCE NUR HALİPÇİ TOPSAKAL

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    BiyolojiKahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ASHABİL AYGAN

    PROF. DR. FATMA KÖKSAL ÇAKIRLAR

  5. Tez No

    893576

    Prokalsitonine karşı selex yöntemiyle aptamer geliştirilmesi

    Development of aptamers against prokalsitonin by selex method

    ÖMER EMECEN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    Moleküler TıpOndokuz Mayıs Üniversitesi

    Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SEZGİN GÜNEŞ

Geri Dön