Effects of metabolic engineering of ethanol utilization pathway in Pichia pastoris on recombinant protein production and transcription levels in central metabolism
Pichia pastoris'in etanol tüketim yolunda yapılan metabolik mühendisliğinin rekombinant protein üretimi ve merkezi metabolizmadaki transkripsiyon düzeylerine etkisi
- Tez No: 688163
- Danışmanlar: PROF. DR. PINAR ÇALIK, PROF. DR. HASAN TUNÇER ÖZDAMAR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2021
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 238
Özet
Bu yüksek lisans tezinde, etanol tüketim hızının artırılması ve etanol yolizi üzerindeki yan-ürünlerin üretiminin azaltılması ile iyi işleyen hücre içi reaksiyon ağının elde edilmesi hedeflenmiştir. Metabolik mühendislik ile etanol yolizi üzerindeki hız kısıtlayıcı reaksiyonları katalizleyen iki enzimin, alkol dehidrogenaz (ADH2) ve Asetil Koenzim A sentaz (ACS1), ayrı ayrı ve beraber aşırı ekspresyonu ile özgün konak Pichia pastoris geliştirilmiştir. Metabolik mühendislik ile geliştirilen yeni Pichia pastoris ekspresyon sistemlerinin; i) ADH2-OE, ii) ACS1-OE, iii) ADH2-OE ve ACS1-OE hücre çoğalması, etanol tüketim hızı ve yan-ürün oluşumuna etkileri araştırılmıştır. ADH2 aşırı ekspresyonunun, PADH2-wt:: ADH2 kaseti ile oluşturulan P. pastoris suşlarının hücre çoğalması üzerine etkisi, üç ADH2 gen kopyası ve dokuz ADH2 gen kopyası taşıyan kolonileri ile %2 (h/h) başlangıç etanol derişiminde araştırılmıştır. Doğal P. pastoris X-33 ile karşılaştırıldığında, üç ve dokuz ADH2 gen kopyası taşıyan hücreler ile sırasıyla 1.11 kat ve 1.35 kat daha düşük hücre derişimi elde edilmiştir. Fermentasyonun t = 36 st'te, P. pastoris X-33 ile üretimle kıyaslandığında, üç ve dokuz ADH2 gen kopyası taşıyan hücreler ile yan-ürün asetik asit derişimleri sırasıyla 1.46 kat ve 3.97 kat, yan-ürün asetaldehit derişimleri de sırasıyla 1.18 kat ve 2.28 kat artmıştır. ADH ve ACS1 aşırı ekspresyonlarının, i)ADH2-OE, ii) ACS1-OE ve iii) ADH2-OE ve ACS1-OE ile oluşturulan P. pastoris suşlarının çoğalması üzerindeki etkisi, %1 (h/h) başlangıç etanol derişiminde araştırılmıştır. Fermentasyon sonunda ADH2-OE ve ADH2-OE+ACS1-OE'ye göre ACS1-OE ile 1.08 kat ve 1.12 kat daha yüksek hücre derişimleri elde edilmiştir. Ayrıca, P. pastoris X-33 ve ADH2-OE'ye kıyasla fermentasyonun t = 36 st'te ACS1-OE için hücre dışına aktarılan asetik asit derişimlerinde 1.49 kat ve 1.78 kat azalma olmuştur. ADH2-OE + ACS1-OE suşları için t = 9 st'te spesifik etanol tüketim hızı (qEtOH) sırasıyla 0.52 and 0.35 g g-1 h-1 olarak bulunmuştur; P. pastoris X-33 (qEtOH = 0.19 gg-1h-1) ile karşılaştırıldığında, ADH2 aşırı ekspresyonunu etanol tüketim hızını artırmıştır. ADH2 ve ACS1'in aşırı ekspresyonunun merkezi karbon metabolizmasının transkripsiyon seviyeleri üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Etanol tüketim yolizi üzerinde yer alan üç enzimi kodlayan genler, ADH2, ALD4 ve ACS1, metabolik mühendislikle tasarlanmış üç ekspresyon sistemininde de upregüle olmuştur. ACS1 aşırı ekspresyonunun r-protein üretimi üzerindeki etkisini araştırmak için, raportör r-protein mApple geninin PADH2-Cat8-L2'nin kontrol altında ekspres edildiği ve ACS1'in PAOX1/Cat8-L3 altında aşırı ekspres edildiği yeni bir ekspresyon sistemi geliştirilmiştir. Geliştirilen bu yeni konak hücre, ACS1-OE-C4+mApple-C1 ile %1 (h/h) başlangıç etanol derişiminde üretimde t= 24 st'te mApple üretiminin 1.2-kat, t=45 st'te ise 1.32-kat arttığı bulunmuştur.
Özet (Çeviri)
The aim of this MSc thesis is to increase the ethanol uptake rate and decrease by-product formation in the ethanol utilization (EUT) pathway and acquire a smoothly operating intracellular reaction network in the target microorganism. A metabolically engineered novel host, Pichia pastoris, was developed by overexpression of the two EUT pathway enzymes, alcohol dehydrogenase 2 (ADH2) and Acetyl-CoA synthetase (ACS1) that catalyze rate-limiting reactions, one by one and together, to understand how they affect the ethanol uptake rate, cell growth, and by-product formation. The metabolically engineered novel Pichia pastoris expression systems constructed were denoted by; i) ADH2-OE, ii) ACS1-OE, iii) ADH2-OE + ACS1-OE. The influence of ADH2 overexpression on the growth of P. pastoris strains constructed with PADH2-wt::ADH2 was investigated in batch cultivations on 2% (v/v) ethanol, with two separate colonies carrying 3 and 9 ADH2 gene copies, named as ADH2-OE-C3 and ADH2-OE-C9, respectively. At the end of the fermentation, compared to P. pastoris X-33 strain, 1.1-fold and 1.35-fold lower cell concentrations were obtained with ADH2-OE-C3 and ADH2-OE-C9, respectively. At t = 36 h of the fermentation, compared to P. pastoris X-33, acetic acid concentrations were 1.46-fold and 3.97-fold higher in ADH2-OE-C3 and ADH2-OE-C9, respectively; while 1.18-fold and 2.28-fold higher acetaldehyde concentrations were obtained with ADH2-OE-C3 and ADH2-OE-C9, respectively. The effects of ADH2 and ACS1 overexpression on the growth of P. pastoris were investigated in batch cultivations on 1% (v/v) ethanol using metabolically engineered strains: i) ADH2-OE, ii) ACS1-OE, and iii) ADH2-OE and ACS1-OE. At the end of the fermentation, compared to ADH2-OE and ADH2-OE+ACS1-OE, 1.08-fold and 1.12-fold higher cell concentrations were obtained with ACS1-OE. Furthermore, specific ethanol uptake rate (qEtOH) at t = 9 h for ADH2-OE and ADH2-OE + ACS1-OE strains were 0.52 and 0.35 g g-1 h-1, respectively. Compared to P. pastoris X-33 (qEtOH = 0.19 gg-1h-1), showing that ADH2 overexpression significantly increased ethanol uptake rate. 1.49-fold and 1.78-fold decrease in excreted acetic acid concentrations compared to P. pastoris X-33 and ADH2-OE were obtained with ACS1-OE at t = 36 h of the fermentation. The effects of overexpression of ADH2 and ACS1 on transcription levels of central metabolism were also investigated. Three genes encoding crucial enzymes in ethanol utilization, ADH2, ALD4, and ACS1, were upregulated in all three metabolically engineered strains. Finally, to investigate the effect of ACS1 overexpression on r-protein production, a novel host strain was constructed in which the gene of the reporter r-protein mApple was expressed under the control of PADH2-Cat8-L2, and ACS1 was overexpressed under PAOX1/Cat8-L3. ACS1-OE-C4 increased mApple production 1.2-fold at t= 24 h of the fermentation, and 1.32-fold at t=45 h of the fermentation.
Benzer Tezler
- Recovery of succinic acid for bio-based C4 bifunctional building block production
Başlık çevirisi yok
ÇAĞRI EFE
Doktora
İngilizce
2011
BiyokimyaTechnische Universiteit Delft (Delft University of Technology)PROF. DR. L. A. M. VAN DER WIELEN
DR. A. J. J. STRAATHOF
- Molecular chracterization of oxidative stress resistant yeast
Oksidatif strese dirençli mutant mayanın karakterizasyonu
NAZLI KOCAEFE
Yüksek Lisans
İngilizce
2012
Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Determination of antibacterial activity mechanism of red rose petal extract
Kırmızı gül yaprağı ekstraktının antibakteriyel aktivite mekanizmasının belirlenmesi
KAZI JANNATUL MARDIA
Yüksek Lisans
İngilizce
2024
Gıda MühendisliğiSakarya ÜniversitesiMühendislik Bilimleri Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SERAP COŞANSU AKDEMİR
- Tutuklanmış maya hücreleri (Saccharomyces cerevisiae) kullanılarak sürekli sistemde etanol üretimi
Ethanol production by using yeast cells (Saccharomyces cerevisiae) in continuous system
PINAR KARAGÖZ
Yüksek Lisans
Türkçe
2007
BiyoteknolojiGebze Yüksek Teknoloji EnstitüsüÇevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MELEK ÖZKAN
- Elektrospinning yöntemi ile gümüş nanopartikül içeren PVP bazlı antibakteriyel nanolif üretimi
Production of the antibacterial PVP nanofibers containing silver nanoparticles via electrospinning method
HAVA ÇAVUŞOĞLU
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
Kimya Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYŞEGÜL MERİÇBOYU