Geri Dön

Molecular chracterization of oxidative stress resistant yeast

Oksidatif strese dirençli mutant mayanın karakterizasyonu

PDF İndir

  1. Tez No: 323656
  2. Yazar: NAZLI KOCAEFE
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Biotechnology, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2012
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 117

Özet

Oksijen aerobik solunum yapan bütün canlılar için hem gerekli hem de zaralıdır. Oksijen ve oksijenden türevlenen oksidantlar hücresel zarara yol açtıkları gibi bazı hastalıklara ve kansere de neden olmaktadır. Lipidler, proteinler ve DNA, reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşturduğu oksidatif stresten etilenmektedir. Canlılar; antioksidant sistemler ve enzimatik mekanizmalar ile oksidatif stresin zararlı etkilerinden korunabilmektedirler. Bunun yanı sıra organizmalar, meydana gelen hasarı düzeltmek adına çeşitli tamir mekanizmaları da geliştirmişler.Reaktif oksijen türleri dioksijenin (O2) farklı durumlarından meydana gelmektedirler. Süperoksit anyonu, hidrojen peroxit, reaktif hidroksil radikalleri en önemli reaktif oksijen türleridir. Bunlar, oksijenli solunum sırasında üretilirler.Reaktif oksijen türevlerinin, oksidatif stresin etkilerinden korunmak için canlıların geliştirdiği antioksidant sistemler, enzimatik yollar ve tamir mekanizmaları gibi korunma yollarını anlamak; hastalıkların, yaşlanmanın ve kanserin doğasını anlamak için çok önemlidir. Bu mekanizmaların anlaşılması için bir model organizmaya ihtiyaç duyulur. S. Cerevisiae mayası, çeşitli özelliklerinden dolayı oksidatif stress çalışmaları için uygun bir model organizmadır.S. cerevisiae ökaryotik ve tek hücreli bir canlıdır. Tek hücreli olması genetik manipulasyonu kolay kılarken, ökaryotik olması diğer ökaryotlar hakkında bilgi edinilmesine olanak sağlamaktadır. Bunun yanında, S. cerevisiae'nin yaşam döngüsünde araştırmalarda oldukça önemli bir yer kaplar. S. cerevisiae yaşam döngüsünde hem haploid hem diploid olan ve doğada poliploidi olarak bulunabilen bir canlıdır. Buna ek olarak diploid formu açlık durumunda mayoz bölünme ile sporulasyona giderek haploid sporları oluşturmaktadır. Bu özelliği araştırmalar için farklı metodlar geliştirilmesine olanak sağlar. Bu özelliklerinden dolayı S. cerevisiae oxidatif stres, kanser ve yaşlanma araştırmalarında en fazla tercih edilen organizmalardan biridir.Bu çalışmada model organizma olarak S. cerevisiae kullanılmıştır. Evrimsel mühendislik yöntemiyle daha once elde edilmiş olan oksidatif strese dirençli mutantın fizyolojik ve moleküler karakterizasyonu yapılmıştır. Mutantın elde edilmesi için başlangıç kültürü öncelikle EMS (etil metan sülfonat) ile rastgele mutasyona tabi tutulmuş, daha sonra sürekli ve giderek artan giden bir hidrojen peroksit stresine maruz bırakılmıştır. Bu rastgele mutasyon ve stres koşulundaki seleksiyon sayesinde oluşan bireylerden oksidatif strese ve yapılan çapraz direnç testlerine en fazla dayanan birey deneylerde kullanılacak mutant olarak seçilmiştir. Çapraz direnç testi; bireylerin ağır metaller, yüksek tuz, yüksek etanol gibi farklı stres koşullarına verdiği tepkiler, üreme durumlarını görmeye yarayan testlerdir.Bu çalışmada S. cerevisiae'nin oksidatif strese direnç mekanizmasını araştırmak için, bu mutant kullanılmıştır. Fenotip analizi için katı besi yerinde yapılan çapraz direnç testi ile mutantın dirençli ya da duyarlı olduğu stres koşulları belirlenmiştir. Bunun için farklı konsantrasyondaki hidrojen peroksit içeren katı besiyerleri ve farklı stres koşullarına sahip (metal, iyon ve farklı bileşikler) katı besiyerlerinde mayalar üretilmiş ve sonuçları gözlenmiştir. Ayrıca kalsiyum ve glutamik ait içeren hidrojen peroksitli katı besiyerlerinde mayalar büyütülmüş, bu sayede kalsiyumun ve glutamik asidin, oksidatif stres direnci üzerine etkileri gözlenmiştir.Ayrıca HPLC (Yüksek Basınçlı Sıvı Kromotografi) ile, üretilen ve tüketilen metabolitler ölçülmüştür. Hem mutant hem yaban tipin farklı üreme koşullarında ve farklı zamanlarda, besi yerindeki glikoz tüketimi, maltoz, etanol, gliserol ve asatet üretimi belirlenmiştir. Hem yaban tip hem de mutant için yapılan bu ölçümler sonucunda, her iki suş için de üretilen metabolit konsantrasyon farklılıkları belirlenmiş, besiyerinde bulunan glikozun bitiş zamanlarındaki fark gözlenmiştir.Ayrıca, enzimatik yöntemlerle hücrede oluşturulan trehaloz ve glikojen konsantrasyonları ölçülmüştür. Trehaloz ve glikojen S. cerevisiae'de stres durumunda üretilen metabolitlerdir. Trehaloz bir disakkarit, glikojen ise polisakkarittir. Hücrede rolü açık olarak bilinmemesine karşın, açlık ve stres durumuna karşı hücrenin depoladığı besin kaynakları olarak bilinir. Bunu yanında protein ve hücre membranı yıkımına karşı saperonlar gibi işlevde gördüğü bilinmektedir. Bu sebeplerden ötürü mutantın ve yaban tipin trehaloz ve glikojen üretim seviyeleri belirlenmiş ve karşılaştırılmıştır. Aynı zamanda HPLC ile trihaloz ve glikojen deneylerinde suşlara hidrojen peroksit uygulanmış ve sonuçta stress faktörünün de bu metabolitlerin üretimi üzerindeki etkisi de gözlenmiş ve karşılaştırılmıştır.Fizyolojik analizlerin yanında gen delesyonu ile hem yaban bireyde, hem de mutant bireyde YAP1 geni silinmiş mutant suş elde edilmiş ve bu suş da farklı konsantrasyona sahip katı besiyerinde üretilerek bu genin üreme ve stres üzerindeki etkisi gözlemlenmiştir.Moleküler analiz kapsamında qPCR (quantitative PCR) ve mikroarray ile yaban tip ve mutanttaki gen ekspresyon düzeyleri belirlenmiştir. Yaban tipin ve mutantın, hem stresli koşulda hem de kontrol koşulunda OCA1, MSN2 ve MSN4 genlerinin ekspresyon düzeyleri belirlenip karşılaştırılmıştır. OCA1 geni hücre döngüsünde kontrol noktasında görev aldığı ve oksidatif stres durumunda merkezi bir etkinliğe sahip olduğu bilinmektedir. Daha önce yapılan araştırmalarda OCA1 hücre döngüsünde anahtar bir rol oynadığı görülmüş. MSN2 ve MSN4 ise Saccharomyces cerevisiae için en önemli genel stres yanıt genlerindendir. Bu sebeplerden ötürü oksidatif strese dirençli mutant mayada bu genlerin ekspresyon düzeyleri incelenmiştir.Daha kapsamlı gen ekspresyon analizi olarak mikroarray yapılmıştır. Yaban tip ve mutantın tüm gene ekspresyon düzeyleri karşılaştırılmıştır. Mutantta ekspresyonu artan ve azalan genler belirlenmiş ve bu genlerin hangi yolaklarda işlev gördüğü araştırılmıştır. Bu sayede organizmadaki bütün genlerin transkripsiyon seviyeleri belirlenerek, organizmanın oksidatif stres durumunda hayatta kalmasını sağlayan yolaklar aydınlatılmıştır. Aynı zamanda, bu çalışmanın verileri yapılan fizyolojik ve fenotipik testleri de desteklemektedir. Çıkan sonuçlara gore, karbon metabolizmasında görev yapan genlerin oksidatif strese dirençli mayada öne çıktığı, bu genlerin transkripsiyon düzeylerinin oldukça yüksek olduğu belirlenmiştir. Özellikle, S. cerevisiae'de stres savunmasında önemli rol oynayan trehaloz ve glikojenin üretiminde rol oynayan genlerin ekspresyon düzeylerinde oldukça yüksek artış gözlenmiştir.Sonuç olarak da, ortaya çıkan bu transkriptomik veriler ile sonraki yapılacak çalışmalar için vizyon oluşturulmuştur.

Özet (Çeviri)

Oxygen is both essential and harmful for aerobic organisms. Oxygen and oxygen derived oxidants cause cellular damages and diseases. As a cellular aspect, cellular components like lipids, proteins and DNA are affected by reactive oxygen species. Antioxidant systems and repair mechanisms protect cells and organisms from their harmful effects.Reactive oxygen species (ROS) are different states of dioxygen. Superoxide anion, hydrogen peroxide and reactive hydroxyl radical constitute in ROS. These are created during oxidative respiration.To understand the protection mechanisms of organisms, a model organism is required. The yeast, Saccharomyces cerevisiae is a suitable organism for oxidative stress studies, because of its properties like being a eukaryotic and unicellular organism. It provides high amounts of information about eukaryotic organisms. It is also easy to work with S.cerevisaie. Furthermore, it has an interesting life cycle. It can be both haploid and diploid. Besides, it undergoes sporulation in starvation conditions. Due to these properties, S. cerevisiae is the most used model organism for oxidative stress, cancer and aging research.In our study, S. cerevisiae was used as a model organism. Oxidative stress resistant mutant had been obtained previously by evolutionary engineering method. EMS mutagenesis had been applied to make random mutation on yeast genome. Hydrogen peroxide was then applied continuously and increasingly, and the most resistant mutants were selected. Following cross-resistance experiments, a more resistant individual was selected as an oxidative stress resistant mutant.To understand resistance mechanism, this resistant mutant was used. Phenotypical experiments were carried out to observe its resistance and sensitivity to different stress factors. For this purpose, spot assay was used with different stress containing solid media. Such as hydrogen peroxide, metal ions or different carbon sources. Furthermore, effects of calcium and glutamic acid on oxidative stress tolerance were investigated for wild type and oxidative-stress resistant mutant.Glucose, maltose, glycerol, ethanol and acetate amounts were measured by HPLC and, trehalose and glycogen amounts were determined via enzymatic analysis. Physiology of oxidative stress resistant mutant was observed via these studies. Glucose utilization, maltose, glycerol, ethanol and acetate production results were reported. The results gave information about differences in metabolite levels and described genrally the metabolism of H2O2 stress resistant mutant.In addition, deletion of YAP1 gene, in the mutant gave on the potential role of this gene in H2O2 resistance mechanism, of the mutant.For gene expression analysis, qPCR was carried out. Expression of some genes which have been desired in the literature to be potentionally important in oxidative stress, was investigated. OCA1, MSN2 and MSN4 expression levels were analyzed by qPCR.For a detailed and global investigation of gene expression, microarray analysis was carried out. Gene expression levels were determined for both wild type and oxidative-stress resistant mutant, and compared to each other. Up-regulated and down-regulated genes were determined and their pathways were investigated.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    451021

    Molecular and physiological characterization of iron resistant Saccharomyces cerevisiae

    Demire dirençli Saccharomyces cerevisiae'nın moleküler ve fizyolojik karakterizasyonu

    BERRAK GÜLÇİN BALABAN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  2. Tez No

    692811

    Molecular characterization of silver-resistant Saccharomyces cerevisiae

    Gümüş stresine dirençli Saccharomyces cerevisiae'nin moleküler karakterizasyonu

    ERGİ TERZİOĞLU

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

    PROF. DR. CENK SELÇUKİ

  3. Tez No

    807476

    Evolutionary engineering of freeze-thaw stress-resistant yeasts without using chemical mutagenesis

    Donma-erime stresine dirençli mayaların kimyasal mutajen kullanılmadan evrimsel mühendislik ile elde edilmesi

    İREM BALABAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  4. Tez No

    456364

    Identification of alternative oxidase encoding genes in Caulerpa cylindracea

    Caulerpa cylindracea türünde alternatif oksidaz kodlayan genlerin tanımlanması

    ÖMER CAN ÜNÜVAR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    BiyokimyaAbant İzzet Baysal Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    DR. ERCAN SELÇUK ÜNLÜ

  5. Tez No

    295330

    Characterization of freeze-tolerant Saccharomyces cerevisiae obtained by evolutionary engineering

    Evrimsel mühendislik ile elde edilen donmaya dirençli Saccharomyces cerevisiae?nin karakterizasyonu

    NECLA SENA ALİKİŞİOĞLU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2011

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

Geri Dön