Production and characterization of heptamerized form of PA83 of Bacillus anthracis in Nicotiana benthamiana plants as vaccine candidate against anthrax
Başlık çevirisi mevcut değil.
- Tez No: 705988
- Danışmanlar: PROF. DR. TARLAN MAMMEDOV
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2021
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Akdeniz Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 87
Özet
Bacillus anthracis (B. anthracis), dünyada biyolojik terör silahı olarak kabul edilen gram pozitif bakteri olan şarbonun etken maddesidir. Hem hayvanlar, hem de insanlar için ölümcül olabilmektedir. Şarbon toksini, toksik olmayan üç proteinden oluşmaktadır; Koruyucu antijen (PA); Ödem faktörü (EF) ve Ölümcül faktör (LF). Koruyucu antijen (PA), şarbon toksininin merkezi bileşeni olup, diğer iki proteinin konakçı hücreye taşınmasından sorumludur. PA83'ün (83kDa) proteolitik aktivasyonundan sonra, PA20 (20kDa) fragmanı serbest bırakılır; kalan PA63 (63kDa), halka şeklinde heptamerler oluşturmak için hızlı bir şekilde kendi kendine birleşmektedirler. Proteolitik bölünme, diğer iki faktör LF/veya EF ile bağlanmaya izin veren heptamer yapısının oluşumu için önemlidir. Doğal konakçıda, B. anthracis PA83 proteini bir glikoprotein değildir, ancak ökaryotik ekspresyon sistemlerinde olduğu kadar bitki ekspresyon sistemlerinde de anormal şekilde glikozillenebilen bazı potansiyel glikosilasyon bölgelerine sahiptir. Anormal glikosilasyon, proteinlerin önemli epitoplarını maskeleyerek uygunsuz katlanmaya yol açabilmektedir. Son zamanlarda, Mamedov vd., bitki bazlı ekspresyon sistemlerinde in vivo deglikosilasyon stratejisini göstermiştir. Bitki bazlı ekspresyon sistemleri, rekombinant proteinlerin üretimi için alternatif bir platformdur. Bu sistemler ölçeklenebilir, ekonomik ve güvenli ürün sağlamaktadırlar. Ek olarak, bitki bazlı ekspresyon sistemleri, proteinlerin biyolojik özelliklerini etkileyen ökaryotik post-translasyonel modifikasyonlara (PTM) sahiptirler. Daha önce yapılan çalışmalarda bildirildiği gibi, bitkide üretilen PA83'ün in vivo deglikosillenmiş monomer formu, şarbona karşı aşı adayı olarak aktif ve istikrarlı bir proteindir. Bu çalışmada, Nicotiana Benthamiana (N. benthamiana) bitkilerinde geçici ekspresyon sistemi kullanılarak, PA83 proteininin in vivo heptamerize formunun üretimini göstermeyi amaçlanmaktadır. Bu nedenle, PA63'ün heptamerize formunu üretmek için, B. anthracis PA83 geni önce deglikosilasyon enzimleri EndoH veya PNGaseF ile birlikte eksprese edildi ve daha sonra in vivo insan furini ile kesilmiştir. Tezle ilgili yapılacak olan çalışma planımız; i) PA63'ün heptamer formunu jel filtrasyon sistemi ile doğrulamak, ii) yüksek seviyeli heptamerize form üretimini optimize etmek, saflaştırmak, karakterize etmek ve iii) proteinleri immünojenisite ve hayvan testleri için incelemektir. Bu nedenle, tüm bu deglikosilasyon ve furin işleme stratejilerini kullanarak, PA83 proteininin in vivo, deglikosile edilmiş, heptamerize formunun, şarbona karşı toplu aşılama için yeni bir potansiyel immünojenik aşı adayı olabileceğini ummaktayız. Ayrıca, deglikosillenmiş PA83'ün heptamer formu, heptamerik yapısı nedeniyle daha stabil olabilmektedir. Çalışma, pandemi döneminde toplu aşılama için önemli olan daha kısa sürede daha güvenli ve ucuz ürünler sağlamak, hedef proteinlerin üretimi için bitki bazlı ekspresyon sistemlerinin umut verici kullanımını da doğrulamaktadır.
Özet (Çeviri)
Bacillus anthracis (B. anthracis) is the causative agent of anthrax, a gram-positive bacterium that is considered a weapon of biological terrorism in the world. It can be fatal for both animals and humans. Anthrax toxin comprises of three non-toxic proteins; Protective antigen (PA); Lethal factor (LF) and Edema factor (EF). PA is the central component of anthrax toxin and is responsible for the transition of EF and LF into the host cell. After proteolytic activation of PA83 (83 kDa), the PA20 (20 kDa) fragment is released; the remaining PA63 (63kDa) is rapidly self-assembled to form ring-shaped heptamers. The proteolytic cleavage is important for formation of heptamer structure, which allows binding with other two factors of LF /or EF. In the native host, B. anthracis PA83 protein is not a glycoprotein but has some potential glycosylation sites. These glycosylation sites can be abnormally glycosylated in eukaryotic expression systems as well as in plant expression systems. Abnormal glycosylation can mask important epitopes of proteins, leading to improper folding. Recently, Mamedov et al., showed the in vivo deglycosylation strategy in plant expression systems. Plant-based expression systems are an alternative platform for the production of recombinant proteins which enables an economical, scalable and safe product. In addition, plant-based expression systems have eukaryotic post-translational modifications (PTMs) that affect the biological properties of proteins. In studies, it has been shown that the in vivo glycosylated monomer form of PA83 produced in the plant is a highly active and stable protein for a vaccine candidate against anthrax. In this thesis study, we aim to demonstrate, the production of in vivo in heptamerized form of the PA83 protein using Nicotiana benthamiana (N. benthamiana) plant's transient expression system. Therefore, to produce the heptamerized form of PA63, the B. anthracis PA83 gene was first co-expressed with the deglycosylation enzymes Endo H and PNGase F and then in vivo cleaved with human furin. Our plan was in this thesis; i) to confirm the heptamer form of PA63 with gel filtration system, ii) to optimize high level heptamerized form production, to purify, characterize and iii) examine proteins for immunogenicity and animal testing. Thus, using all these deglycosylation and furin processing strategies, the in vivo-deglycosylated, heptamerized form of the PA83 protein could be a new potential immunogenic vaccine candidate for mass vaccination against anthrax. Also the heptamer form of deglycosylated PA83 can be more stable because of its heptameric structure. In addition, the study confirms the use of plant expression systems to get target proteins is a useful tool to produce safer and cheaper products in a short period, which is crucial for mass vaccination during the pandemic.
Benzer Tezler
- Production and characterization of activated carbon from pyrolysis of copolymers
Kopolimerlerin pirolizinden aktif karbon ürertimi ve karakterizasyonu
ARZU ÖZTÜRK
Yüksek Lisans
İngilizce
1999
Kimya MühendisliğiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HAYRETTİN YÜCEL
- Degrade olabilen metilselüloz esaslı filmlerin üretimi ve karakterizasyonu
Production and characterization of degradable methylcellulose based films
KAMİLE NAZAN TURHAN
Doktora
Türkçe
1999
Gıda MühendisliğiHacettepe ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ.DR. FERHUNDE ŞAHBAZ
- Production and characterization of aluminum matrix-tic composites by vacuum sintering
Aluminyum matriks-tic kompozitlerin vakum sinterleme metoduyla üretimi ve karakterizasyonu
RIZA ALPARSLAN SEYMEN
Yüksek Lisans
İngilizce
1998
Metalurji MühendisliğiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiMetalurji ve Malzeme Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ALİ KALKANLI
- Kitosan ilaç taşıyıcı sistemlerinin üretimi ve karakterizasyonu
Production and characterization of Chitosan drug carrier systems
MEHMET SEYYAL
Yüksek Lisans
Türkçe
1998
BiyomühendislikHacettepe ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ERHAN PİŞKİN
- Production and characterization of poly (Lactide) based biodegradable nonwoven matrices
Biyoparçalanabilir polilaktat bazlı nonwoven matrikslerin üretim ve karakterizasyonu
AHMET KOZLUCA
Doktora
İngilizce
1998
Kimya MühendisliğiHacettepe ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ERHAN PİŞKİN