Protein engineering applications of novel esterase enzyme using rational design and directed evolution approaches
Rasyonel tasarım ve yönlendirilmiş evrim yaklaşımlarıyla yeni esteraz enziminin protein mühendisliği uygulamaları
- Tez No: 720165
- Danışmanlar: PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyomühendislik, Biyoteknoloji, Bioengineering, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 95
Özet
Enzimler, canlı organizmalarda katalizör görevi gören ve kimyasal reaksiyonların ilerleme hızını kendilerini değiştirmeden düzenleyen, genellikle protein yapılı biyomoleküllerdir. Enzimlerin endüstride biyokatalizörler olarak kullanılabilmeleri için enzimlerin istenilen reaksiyon koşullarına uygun özelliklere (yüksek aktivite, substrat özgüllüğü, ekstrem koşullara dirençlilik vb.) sahip olması gerekmektedir. Buna rağmen enzimler çeşitli reaksiyon koşullarında kullanılmak için her zaman gereken özelliklere sahip değildir. Bu nedenle, doğada ihtiyaç doğrultusunda uzun zaman sürecinde meydana gelebilecek genomik değişiklikler laboratuvar ortamında meydana getirilerek enzimlerin özelliklerinin geliştirilmesi ve istenilen reaksiyon koşullarında çalışabilir hale getirilmesi gerekmektedir. Bu amaç doğrultusunda protein mühendisliği yöntemleri kullanılarak eşsiz özelliklere sahip enzimler elde edilebilmektedir. Esteraz enzimi sanayide deterjan, gıda, kozmetik, farmasötik, biyoyoakıtlar gibi bir çok farklı alanda kullanımı nedeniyle endüstriyel açıdan büyük bir öneme sahiptir. Kısmen suda çözünerek ester bağlarını hidrolize eden bu makromoleküller hala zorlu endüstri koşullarına uyum sağlayabilecek durumda olmaması ve ihtiyaç duyulan düzeyde aktivite gösterememesi nedeniyle esteraz enziminin var olan özelliklerinin geliştirilmesi ve enzime yeni özelliklerin kazandırılmasına yönelik çalışmalar devam etmektedir. Protein mühendisliği metodları zorlu şartlarda çalışabilen enzimler elde edebilmek için en verimli yollardan biridir. Bu metodlar ekstrem koşullarda yaşayan mikroorganizmalardan izole edilen enzimlere uygulandığında daha üstün yeteneklere sahip enzimlerin üretilebilmesi mümkündür. Ekstrem koşullarda yaşayan mikroorganizmalar belirli mutasyonların kendiliğinden gelişmesiyle ekstrem koşullara adaptasyon sağlayabilmektedirler. Bu mikroorganizmaların adaptasyon eğilimleri sayesinde sahip oldukları enzimlerine protein mühendisliği yöntemleri uygulandığında endüstrinin ihtiyaçlarını karşılayabilecek özelliklere sahip enzimler elde edilebilmektedir. yakın zamanda grubumuz tarafından yüksek tuz konsantrasyonuna sahip Acıgöl'den dizi bazlı metagenomiks çalışmalarıyla izole edilen ve tanımlanan mikroorganizmalar arasında yer alan, gen dizisi Halolamina sediminis genomunun bir parçasına %75 oranında; aminoasit dizisi ise Halomonas gudaonensis organizmasının esterazına %91 oranında benzeyen esteraz(hAGEst) enzimi rekombinant olarak üretilmiş ve biyokimyasal karakterizasyonu tamamlanmıştır. Bu tez kapsamında ise, tanımlanmış olan yeni esteraz enziminin literatürde yaygın olarak kullanılan protein mühendisliğinin iki temel yaklaşımı kullanılarak 3 boyutlu yapının araşturılması ve substrat özgüllüğünün geliştirilmesi hedeflenmiştir. İlk olarak rasyonel dizayn yaklaşımının temel yöntemlerinden biri olan bölgeye özgü mutagenez kullanılmıştır. Yeni esteraz proteininin üç boyutlu yapısını tahmin etmek için , SWISS MODEL yazılımıyla Protein Veri Bankası (PDB) incelendiğinde yeni esteraz enziminin esteraz ybfF proteini ile en yüksek benzerliğe sahip (%34) olduğu görülmüştür. Bu yöntem sayesinde aktif bölgede olduğu tahmin edilen 209. serinin ve oksianyon deliğinde bulunduğu tahmin edilen 88. metiyoninin, alanin amino asidiyle değiştirilmesi amaçlanmış ve bu aminoasitlerin yapıdaki önemi incelenmiştir. Ser209Ala ve Met88Ala mutasyonlarını elde etmek için primerler tasarlanarak Q5 Site-Directed Mutagenesis kitiyle gen çoğaltılmıştır. E. Coli C43 hücrelerine transforme edilip çıkan transformantlardan rastgele seçim yapılarak sanger dizilemeye gönderilmiştir. Dizileme sonucuna göre istenilen mutasyonların elde edildiği görülmüştür. Protein ekspresyonu için 1 mM IPTG eklenmiş ve ardından 30 °C'de 6 saatlik bir inkübasyon ile uyarılmıştır. Ser209Ala ve Met88Ala mutant esteraz genlerini içeren pET-28a(+) vektöründen gelen proteinler daha sonra 6xHis etiket tekniği kullanılarak saflaştırılmış ve SDS-PAGE analizi kullanılarak kontrol edilmiştir. Ser209Ala ve Met88Ala için IPTG ile gen ekspresyonu indüklendikten sonra 25-35 kDa aralığında bantlar gözlendi. Esterazların moleküler ağırlığı 27 ile 54 kDa arasında değiştiğinden, doğru bantta olduğu doğrulanmıştır. Sonraki aşamada, His-tag purifikasyon yöntemiyle saflaştırılan protein, ultrafiltrasyon yapılarak SDS-PAGE görüntülerine göre istenmeyen proteinlerden uzaklaştırılmıştır. Bradford reagent kullanılarak saf olarak elde edilen proteinin konsantrasyon ölçümü yapılmıştır. Bradford analizine göre Ser209Ala mutant esteraz için 20 mg/ml, Met88Ala mutant esteraz için 20 mg/mL ve yabanıl tip esteraz için 30 mg/mL olarak ölçülmüştür. 1 µM yabanıl tip, Ser209Ala ve Met88Ala mutant esteraz enzimleri 50 mM Tris- HCl pH:8 tampon çözeltisinde hazırlanan 1 mM Para-nitrofenol (pNP) hexaonate substratında 30 ºC'de 20 dakika boyunca inkübe edilmiştir. Kinetik aktivite için bağımsız üç deney tekrarı yapılarak 410 nm dalga boyunda absorbansları ölçülmüştür. Bu sonuçlara göre, yabanıl türün aktivitesi, Ser209Ala ve Met88Ala mutant esterazların aktivitesiyle kıyaslandığında %87.1 ve %17.7 oranında düştüğü saptanmıştır. Bu sonuçlar, aktivitenin ciddi ölçüde azalmasına bağlı olarak 209. serin amino asidinin esteraz enziminin aktif bölgesinde yer aldığını ve esteraz enziminin aktivitesi üzerinde doğrudan etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Aktivitede %17.7 düşüşe neden olduğu için 88. metiyonin kalıntısının aktiviteyi etkilediği, ancak oksianyon deliğinde büyük bir öneme sahip olmadığı kanısına varılmıştır. Çalışmanın ikinci kısmında ise yönlendirilmiş evrim yaklaşımıyla geniş bir kütüphane oluşturulması amaçlanmıştır. Hata-eğilimli polimeraz zincir reaksiyonu uygulanarak elde edilen bu kütüphaneden substrat spesifitesi geliştirilmiş mutant esteraz enzimlerinin seçilmesi hedeflenmiştir. Bu kapsamda, başta esterazlar olmak üzere literatürde çalışılan enzimler ve bu enzimlere uygulanan hata eğilimli PZR koşulları detaylı bir şekilde incelenerek hAGEst enzimi için en uygun koşullar belirlenmiş ve uygun primerler tasarlanmıştır. Mutant enzim varyantları oluşturmak için uygun bir hata-eğilimli PZR reaksiyonu adenin ve guanin nükleotit konsantrasyonlarının azaltılması ve timin ve sitozin nükleotit konsantrasyonlarının arttırılmasıyla sağlanmıştır. Aynı zamanda temin edilen hatayı düzeltme özelliğine (proofreading) sahip olmayan Taq DNA polimeraz kullanılmıştır. Ek olarak, normal PCR koşullarında 1.5 mM olan MgCl2 konsantrasyonun 5 mM'a arttırılmasıyla ve 0.25 mM MnCl2 eklenmesiyle optimum mutasyon oluşumu hedeflenmiştir. PCR ürünü ve pET-28a (+) EcoRI ve HindIII endonükleaz enzimleri ile kesildikten sonra 260 nm ve 280 nm“NanoDrop”ekipmanları ile absorbans oranı ölçülerek saflık değerlendirilmiştir. Ayrıca numunelerin kalitelerinin belirlenmesi amacıyla A260/A280 oranı hesaplanmıştır. 5:1 ve 7:1 (insert: vector) oranlarına göre ligasyon kurularak E. coli C43 kompetan hücrelerine transforme edilmiştir. Mutasyonlar sonucu çeşitli genetik farklılıklar oluşturulduktan sonra 159 transformanttan oluşan kütüphane elde edilmiştir. Tribütirin agar plate ile lipolitik aktivite gösteren 58 mutant elde edilmiştir. Elde edilen bu 58 mutantın IPTG indüksiyonuyla (6 saat boyunca 30 oC de inkübasyona bırakılarak) protein ekspresyonu sağlanmıştır. Eksprese edilen proteinler, BugBuster protein ekstraksiyon reaktifi kullanılarak ekstrakte edilmiştir. 58 mutantın her biri için protein miktarı Bradford analiziyle ölçülmüştür ve her bir örnekte reaksiyona giren protein miktarı eşit konsantrasyonda olacak şekilde dilüe edilmiştir. 4-nitrofenil hekzanoat (6C'lu) ve 4-nitrofenil dodekanoat (12C'lu) substratları ile hem yabanıl türün hem de mutantların aktivitesi üç tekrarlı olarak ölçülmüştür. 58 mutantın her biri için absorbans değeri üç kez ölçülmüş ve bu değerlerin ortalaması alınmıştır. Mutantların tüm kinetik aktivite karşılaştırması incelendiğinde, yabanıl tipe kıyasla önemli ölçüde daha yüksek aktiviteye sahip mutant bulunamamıştır. Kontrol kesiminden sonra Mutant48, Mutant52 ve Mutant53 12C'lu dodekanoat substratına karşı yabanıl esteraz enziminden daha fazla aktivite gösterdiği için; Mutant11 ve Mutant36 hem 6C'lu hekzaonat ve hem de 12C'lu dodekanoat substratlarına karşı yabanıl tip esteraz enziminden daha fazla aktivite gösterdikleri için seçilmiştir. Son olarak; iki substrat için yabanıl tip esteraz enziminden daha düşük aktivite gösteren Mutant6 ve Mutant23; rastgele olarak da Mutant 11 seçilmiştir. Seçilen 8 mutant için DNA dizi analizleri yapılmıştır. CLUSTAL OMEGA kullanılarak bu mutantlar için elde edilen DNA dizi verileri yabanıl tip ile karşılaştırıldığında, seçilen tüm mutantların vahşi tip esteraz enzimi ile aynı gen dizisine sahip olduğu görülmüştür. Elde edilen bu sonuçlara göre 6 ve 12C'lu yağ asitlerini substrat olarak kullanılabilecek mutant esteraz enzimleri elde edilememiş ya da mutasyon oranının yüksek olması nedeniyle mutasyona uğramış koloniler aktivitelerini kaybettiği için aktivite taraması sırasında elenmiştir. Bundan sonraki çalışmalarda farklı tarama stratejileri kullanılarak kütüphane taranmaya devam edilecek ve mutantların dizi analizleri tamamlanacaktır. Mutantların aktivitesini gözlemlemek için farklı sayıda C içeren alternatif yağ asitleri substrat olarak kullanılacaktır. Bunun yanısıra, hataya-eğilimli PCR deneylerinin farklı koşullarda kurulması ve farklı yöntemlerin kombinasyonlarından oluşan protein mühendisliği yaklaşımları kullanılarak esteraz enziminin özelliklerinin iyileştirilmesi sağlanacaktır. Bu sayede, endüstrinin ihtiyacını karşılayabilecek özelliklere sahip esterazların eldesiyle, ülke ekonomisine ve literatüre katkı sağlanması mümkün olabilecektir.
Özet (Çeviri)
Enzymes mostly are protein-structured biomolecules that act as catalysts in living organisms. They regulate the rate at which chemical reactions proceed without altering themselves. Enzymes should have properties that are suitable for the desired reaction conditions to be used as biocatalysts in industry (high activity, substrate specificity, resistance to organic solvents, etc.). However, enzymes do not always have the properties required for use in a variety of reaction conditions. So, it is necessary to develop the properties of enzymes for the desired reaction conditions. Protein engineering strategies can be used to create enzymes with unique properties for this purpose. Esterase enzyme has great industrial importance due to its use in many different areas such as detergent, food, cosmetics and pharmaceuticals. Since esterases, which partially dissolve in water and hydrolyze ester bonds, are still able to adapt to harsh industrial conditions and do not have the required level of activity, studies are ongoing to improve the existing properties of the esterase enzyme and to bring new features. Protein engineering methods are one of the most efficient ways to obtain enzymes that can work under harsh conditions. If these methods are applied to enzymes isolated from microorganisms living in extreme conditions it is possible to produce enzymes with superior abilities. Microorganisms living in extreme conditions can adapt to extreme conditions by the construction of certain mutations spontaneously. When protein engineering methods are applied to the adaptation tendencies of these microorganisms and their enzymes with superior properties, enzymes that can meet the needs of the industry can be obtained. Recently, our group isolated and identified microbial diversity of the samples by a sequence-based metagenomic approach using environmental samples collected from Acıgöl, which has a high salt concentration. The esterase(hAGEst) enzyme was produced recombinantly and its biochemical characterization was completed successfully. The amino acid sequence of the esterase enzyme is 91% similar to the esterase of the Halomonas gudaonensis organism, and the gene sequence is 75% similar to a part of the Halolamina sediminis genome. This thesis aimed to determine the three-dimensional(3-D) structure and improve the substrate specificity of the newly defined esterase enzyme using two basic approaches of protein engineering, which are widely used in the literature. Firstly, Site-Directed Mutagenesis was used, which is one of the basic methods of the rational design approach. To predict the 3-D structure of the new esterase protein, when the Protein Data Bank (PDB) was examined with the SWISS-MODEL software, it was seen that the new esterase(hAGEst) enzyme had the highest similarity (34%) with the esterase ybfF protein. Thanks to this method, the importance of these amino acids in the structure were investigated by replacing the 209th serin amino acid residue, which is estimated to be in the active region, and the 88th methionine, which is estimated to be in the oxyanion hole, with alanine amino acid. Primers were designed to obtain the Ser209Ala and Met88Ala mutations. The gene was amplified using the Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit and was transformed into E. Coli C43 cells. Colonies were randomly selected from the resulting transformants sent for sanger sequencing. The DNA sequencing results indicated that the desired mutations were obtained successfully. Protein expression was initially stimulated by the addition of 1 mM IPTG, followed by a 6-hour incubation at 30 °C. The proteins from the pET-28a(+) vector containing the Ser209Ala and Met88Ala mutant esterase genes were then purified utilizing the 6xHis tag technique, and SDS-PAGE analysis was used as a control. Bands in the range of 25-35 kDa were observed after inducing gene expression with IPTG for Ser209Ala and Met88Ala. The results verified the molecular weight of esterases ranges between 27 and 54 kDa. In the next step, the protein purified by His-tag purification was removed from the unwanted proteins according to the SDS-PAGE images by ultrafiltration. The concentration of the pure protein was measured by using Bradford reagent. It was measured at 20 mg/mL for Ser209Ala mutant esterase, 20 mg/mL for Met88Ala mutant esterase and 30 mg/mL for wild-type esterase according to Bradford analysis. 1 µM of wild type enzyme, Ser209Ala and Met88Ala mutant enzymes were incubated in 1 mM para-nitrophenol (pNP) hexanoate substrate prepared in 1 mM Tris-HCl pH:8 buffer solution at 30 ºC for 20 minutes. For kinetic activity, three independent experiments were repeated and absorbance was measured at a wavelength of 410 nm. According to these results, the activity of wild type was found to be decreased by 87.1% and 17.7%, when compared to the activity of Ser209Ala and Met88Ala mutant esterases, respectively. These results show that the 88th methionine amino acid is located in the active site of the esterase enzyme due to the serious decrease in the activity and has a direct effect on the activity of the esterase enzyme. However, it was thought that the 88th methionine residue is not of great importance in the oxyanion hole, since a small decrease in the activity is observed by 17.7%. The second part of the study aimed to create a large library with the directed evolution approach. To improve the substrate specificity of the enzyme, the library was created by using the Error-Prone PCR . It would help to develop esterase enzyme for the needs of the industry. So, it may contribute to the national economy and literature by obtaining esterases with superior properties. Firstly, the enzymes studied in the literature, especially esterases, and the Error-Prone PCR conditions applied to these enzymes were examined in detail, the most suitable conditions for the hAGEst enzyme were determined and suitable primers were designed. A suitable Error-Prone PCR reaction to generate mutant enzyme variants was achieved by decreasing adenine and guanine nucleotide concentrations and increasing thymine and cytosine concentrations. Also, commercially available Taq DNA polymerase, which does not have proofreading, was used. In addition, by increasing the concentration of 5 mM MgCl2 and adding 0.25 mM MnCl2, optimum mutation formation was targeted. After cleavage with EP-PCR product and pET-28a(+) EcoRI and HindIII endonuclease enzymes, the determination of purity was calculated by measuring the ratio of absorbance with 260 nm and 280 nm NanoDrop equipment. Also, the qualities of samples were assessed by calculating the ratio of A260/A280. They were transformed into E. Coli cells by ligation according to the ratios of 5:1 and 7:1 (insert:vector). After establishing various genetic differences as a result of mutations, a library of 159 transformants was obtained. 58 mutants showing lipolytic activity were obtained with tributyrin agar plate screening. Protein expression was ensured by IPTG induction (incubation at 30 °C for 6 hours) of the obtained 58 mutants. Expressed proteins were extracted by using the BugBuster protein extraction reagent. The amount of protein was quantified for each of the 58 mutants by Bradford analysis and diluted to keep the equal amount of reacted protein. The activity of both wild-type and mutants was measured in triplicate with the substrates 4-nitrophenyl hexanoate (6C) and 4-nitrophenyl dodecanoate (12C). The absorbance value was measured three times for each of the 58 mutants, and these values were averaged. When the all kinetic activity comparison of mutants were examined, no mutant with significantly greater activity was found compared to wild type. After control cleavage, Mutant48, Mutant52 and Mutant53 were selected as they showed greater activity against the 12C dodecanoate substrate than the wild-type esterase enzyme. Mutant11 and Mutant36 were selected because they showed greater activity than the wild-type esterase enzyme against both 6C hexanoate and 12C dodecanoate substrates. Finally, Mutant6 and Mutant23 showed lower activity than the wild-type esterase enzyme for the two substrates; Mutant 11 was chosen randomly. DNA sequences of 8 selected mutants were analyzed. When sequencing data for these mutants using CLUSTAL OMEGA were aligned with wild type, it was seen that all the potential mutants had the same gene sequence as the wildtype esterase enzyme. As a result of the study, mutant esterase enzymes that could be used as a substrate for 6 and 12C fatty acids could not be obtained or due to the high mutation rate, mutated colonies lost their activity and were eliminated during activity screening. The library will continue to be scanned using different screening strategies. In further studies, fatty acids with a different number of C can be used as alternative substrates to observe the activity of mutants. Error-Prone PCR experiments might be set up under different conditions and the properties of the esterase enzyme might be improved by using protein engineering approaches consisting of combinations of different methods. In this way, it will be possible to contribute to the national economy and literature by obtaining esterases that can meet the needs of the industry.
Benzer Tezler
- Protein engineering applications on novel hAGEst enzyme for changing substrate specificity
Özgün hAGEst enziminin substrat özgüllüğünün değiştirilmesine yönelik protein mühendisliği uygulamaları
EREN BÜYÜKYAVUZ
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
Biyomühendislikİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
- Alanine scanning on the active site of a novel esterase
Yeni bir esteraz enziminin aktif bölgesinde alanin taraması
SEDA KARAKAŞ
Yüksek Lisans
İngilizce
2018
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL-KARAGÜLER
- Protein engineering applications for functional enhancement of cellulase and lipase enzymes
Lipaz ve selülaz enzimlerinin fonksiyonel özelliklerinin protein mühendisliği uygulamaları ile arttırılması
ASLI YENENLER
- Protein engineering applications on industrially important enzymes
Endüstriyel öneme sahip enzimlerin protein mühendisliği uygulamaları
GÜLŞAH ÖZGÜN
Doktora
İngilizce
2019
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
- Biyomedikal uygulamalar için kendi kendini onaran yenilikçi malzemelerin geliştirilmesi ve karakterizasyonu
Development and characterization of novel self-healing materials for biomedical applications
DİLARA YILMAZ AYKUT
Doktora
Türkçe
2023
Kimya Mühendisliğiİstanbul Üniversitesi-CerrahpaşaKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HÜSEYİN DELİGÖZ
DR. ÖĞR. ÜYESİ AYÇA BAL ÖZTÜRK