Protein engineering applications on novel hAGEst enzyme for changing substrate specificity
Özgün hAGEst enziminin substrat özgüllüğünün değiştirilmesine yönelik protein mühendisliği uygulamaları
- Tez No: 546167
- Danışmanlar: PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyomühendislik, Biyoteknoloji, Genetik, Bioengineering, Biotechnology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2019
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 79
Özet
Son yıllarda, biyo-çözünürlük ve yüksek seçicilik gibi çeşitli avantajlarından dolayı biyolojik katalizörlerin farklı endüstri alanlarında kullanımına yönelim artmaktadır. Bununla beraber, biyolojik katalizörlerin endüstriyel işlemlerin parametrelerine uygun olmaları gerekmektedir. Ancak enzimlerin kararlılığı ve doğal yapılarını koruma eşiği, endüstriyel işlemlerde meydana gelen yüksek sıcaklık ve basınç gibi sert stres koşullarında çok düşüktür. Bunun sonucunda enzimlerin endüstriyel kullanımına yönelik istenilen verimlilik elde edilememektedir. Nanoteknoloji, metabolizma mühendisliği, immobilizasyon gibi çeşitli strateji ve yöntemlerin kullanılmasıyla, sert endüstriyel koşullarda bulunan enzimlerin yapı ve katalitik özelliklerinin korunması ve verimliliğin daha da artırılmasına yönelik çalışmalar yoğun olarak sürdürülmektedir. Yukarıda bahsi geçen strateji ve yöntemlerin yanı sıra protein mühendisliği, mutagenez ile enzimlerin yapısında ve fonksiyonlarında meydana gelen değişikliklerin sonucunu kontrol etme fırsatı sağlayan diğer bir yaklaşım olarak bilinmektedir. Protein mühendisliğinde, rasyonel ve yönlendirilmiş evrim olarak bilinen iki temel yaklaşım ve bu iki yaklaşımın kombinasyonunu içeren bir yöntem olarak yarı rasyonel dizayn kullanılmaktadır. Bu yöntemler sayesinde proteinin amino asit dizisinde değişiklikler meydana getirilerek, enzimin aktif bölgesinde, substrat bağlanma bölgesinde, üç boyutlu yapısında farklılıklar elde edilebilir. Bu da proteinin aktivitesinde değişikliğe neden olmaktadır. Bu çalışmada, yukarıda belirtilen bu yöntemlerden rasyonel dizayn yaklaşımı olarak bilinen bölgeye özel mutasyon (site directed mutagenesis) metodu ve bölge saturasyon mutagenez yöntemi (site saturation mutagenesis) kullanılmıştır. Bölgeye özgü mutasyon yönteminde, hedefe uygun olarak değiştirilmek istenen amino asit belirlenir. Bu amino asit yerine gelmesi istenen amino aside uygun primer dizayn edilir. Polimeraz zincir reaksiyonu ile istenen mutasyon elde edilir. Bölge saturasyon mutagenez yönteminde ise mutasyonun yeri önceden belirlenir ancak, o bölgedeki amino asit yerine hangi amino asidin geleceği bilinmez. O bölgede çok sayıda, farklı mutasyon elde edilir. Esteraz enzimi hidrolaz enzim grubuna aittir ve ester bağının oluşması ve parçalanmasından sorumludur. Esteraz enziminin insan, hayvan, bitki ve farklı mikroorganizmalar olmak üzere çeşitli üreticileri bulunmaktadır ve saflaştırılan esteraz enzimi gıda ve içecek, parfüm, kimya, tarım ve ilaç sanayii gibi geniş endüstri alanlarında kullanılmaktadır. Ancak bahsedilen ağır endüstri parametreleri ve yeni potansiyel kullanım alanları, esteraz enziminin dayanıklılığını, verimliliğini ve farklı substratlara karşı reaktifliğini arttırmak amacıyla farklı yaklaşımlara ihtiyaç duymaktadır. Bu tez kapsamında protein mühendisliği yöntemleri kullanılarak, grubumuz tarafından daha önceki çalışmalar ile tanımlanmış olan metagenomik kaynaklı özgün esteraz enzimi üzerinde çalışılmıştır. Burada amaç metagenomik yöntem ile yüksek sıcaklık, basınç, yüksek tuzluluk oranı gibi aşırı koşullarda yaşayan canlıların bu özelliklerinden faydalanmak ve sert endüstriyel koşullara uygun enzimler elde edebilmektir. Bu amaçla öncelikle substrat özgüllüğünden sorumlu amino asit rasyonel dizayn yöntemi ile tanımlanmış ve enzimin substrat özgüllüğünün değiştirilmesine yönelik yarı rasyonel dizayn yöntemi uygulanmıştır. Öncelikle, D111A mutant esterazı oluşturabilmek amacıyla rasyonel dizayn yaklaşımı olarak bilinen bölgeye özel mutasyon (site directed mutagenesis) metodu kullanılmıştır. Bu amaç için, özgün esterazı kodlayan gen pET-28a (+) bakteriyel vektörüne tanıtılmıştır. Sonrasında, 111. pozisyonda bulunan aspartik asidi kodlayan bölgeyi mutasyona uğratan özel primerler oluşturulmuştur ve bu primerler, PCR da kullanılarak bölgesel yönlendirilmiş mutasyon gerçekleştirilmiştir. Ürünler, kontaminasyonu engellemek için kanamisin bulunduran agar plakaya ekilmiştir ve üretilen kültürden, agaroz-jel elektroforezi sonucu en yoğun floresanı gözlemlediğimiz 5 tane koloni seçilerek dizi analizine gönderilmiştir. Dizi analizi sonuçları, amaçlanan mutasyonun elde edildiğini onaylamıştır. Dizi analizinden sonra, D111A mutantları saflaştırılmış ve ultrasantrifüj ile daha yoğun hale getirilmiştir. Sonrasında, enzim aktivitesine bakılmış ve mutantın kinetik ölçümleri belirlenmiştir. Kinetik ölçümlere göre, daha önceki çalışmalar ile elde edilmiş olan Ser87A ve His237A mutantları gibi Asp111A mutantının da esteraz enziminin gösterdiği katalitik aktiviteyi göstermediği tespit edilmiştir. Bu sonuçlar, 87. pozisyondaki serinin, 111. pozisyondaki aspartik asidin ve 237. pozisyondaki histidinin katalitik üçlü de denilen özgün esteraz enziminin aktif bölgesini oluşturduğunu açıklamaktadır. İkinci olarak, daha önceki çalışmalarımızda bölge saturasyon mutagenez yöntemi (site saturation mutagenesis) kullanılarak dizayn edilen mutantlar farklı analizler ile incelenmiştir. Daha önceki çalışmalar kapsamında, enzim dizisinde bulunan üç farklı bölgede bölge saturasyon mutasyonu ile 300 mutant elde edilmiştir. Substrat bağlanma bölgesine yakınlığından dolayı sırasıyla histidin, triptofan ve tirozine denk gelen 121, 238 ve 211 numaralı amino asitler bölge saturasyon mutagenez yöntemine tabii tutulan amino asitler olarak belirlenmiştir. İlk önce, mutant hücreler (C43 Escherichia coli) protein ekspres etmek için üç tekrarlı şekilde Luria Bertani sıvı besi yerine ekilmiştir ve sonradan BugBuster ekstraksiyon reaktifi ile alınmıştır. Protein ekspresyon doğruluğu, rastgele seçilen mutantlar için SDS-PAGE ile kontrol edilmiştir ve kalın-koyu bant çalışılan proteini (28 kDa) içeren aralığı gösteren 25-35 kDa olarak gözlemlenmiştir. İstenilen bant pozisyonunun gözlemlenmesi, enzim kinetiği deneyi ile devam edilmesini sağlamıştır. Aktivite testi doğal fenotip ve tüm mutant tekrarları için yürütülmüştür. Substrat olarak, sadece doğal fenotipe spesifik olan (6C) değil kontrol amaçlı ek olarak başka bir 6C`lu 4-Nitrofenil hekzanoat ve 12C`lu 4-Nitrofenil dodekanoat kullanılmıştır. En az doğal fenotip kadar yüksek absorbans sonuçları, sonraki analizler için dizayn edilmiş en iyi mutantın seçilmesine yol göstermiştir. Bu nedenle H121X-D3, W238X-E6, W238X-E11, W238X-F3 ve Y211X-H2 olacak şekilde esteraz enzim dizisindeki değişimi anlamak amacıyla 5 mutant dizi analizi için seçilmiştir. Dizilenen baz çifti sayısı ve seçilen pozisyondaki amino asit değişimi, protein saflaştırmasına devam etme kriteri olarak doğal fenotip ile karşılaştırılmıştır. En yüksek absorbans değerine sahip H121R-, W238S-, W238W ve Y211A mutantlarının yüksek saflıkta elde edilmeleri sonucunda, 6C`lu ve 12 C`lu substratlara karşı spesifik aktiviteleri belirlenmiştir. Orijinal esteraz aktivitesi ile karşılaştırıldığında, W238S mutant esteraz enziminin diğer mutantlara kıyasla 6C`lu ve 12C`lu substratlara karşı orijinal esteraz enzimi ile aynı aktiviteye sahip olduğu gözlenmiştir. Elde edilen bu mutant enzimlerin 12C'lu substrat dışında farklı substratlara karşı da aktivitesi kontrol edilebilir. Ayrıca bölge saturasyon mutagenez yönteminin (site saturation mutagenesis) avantajı olan çok sayıda olası mutantın elde edilmesi, çalışılmayan diğer örneklerin de farklı substratlara ilgisinin olma ihtimalini ortaya çıkarmaktadır. Bu örnekler tekrar taranarak, farklı substratlara olan ilgisi araştırılabilir.
Özet (Çeviri)
There has been an increased tendency to usage of biocatalysts in various fields of industry because of multiple advantages such as biodegradability and high selectivity. Therewithal, biocatalysts should be proper for industrial processing parameters yet stability of enzyme is extremely low under severe stresses like high temperature and pressure. Various strategies such as nanotechnology, metabolism engineering and immobilization are extensively used to stabilize the structural and chemical properties of enzymes in harsh industrial conditions. Protein engineering is another approach that allows you to control the outcome of changes in the structure and function of enzymes by introducing the mutants. In protein engineering, two basic approaches known as rational and directed evolution are used: semi-rational design, which includes a combination of these two. The esterase enzyme belongs to hydrolases enzyme group and esterase enzyme is responsible to hydrolyse and form ester bond. There are several producers of esterase enzyme like human beings, animals, plants and different microorganisms and purified esterase enzyme is usable in wide range of industrial area such as food and beverage, perfume, chemical, agriculture, pharmaceutical industry. However, mentioned severe industry processing parameters and potential new usage fields requires different approaches to increase stability and reactivity of the esterase enzyme for different substrates. In the scope of this thesis, the amino acid residues responsible for the substrate specificity on a novel esterase enzyme which was previously defined as a result of metagenomic studies by our group were determined. Then the semi-rational design was applied to change its substrate specificity. Firstly, D111A mutant esterase was constructed by using the site-directed mutagenesis which is a well-known rational design approach. For this aim, the novel esterase encoding gene was introduced into pET28a (+) bacterial vector. Then, specific primers that create mutation at the region that codes aspartic acid at 111th position produced and site-directed mutagenesis performed by using these primers at PCR reaction. Then, the produced D111A mutant esterases transformed into Escherichia coli C43 competent cells. The products spreading to agar plates that contain kanamycin to prevent contamination and 5 different colonies chosen from the culture and as a result of agarose gel electrophoresis, mutants with intense fluorescence which means colonies with more mutant genetic materials, sent to sequencing. Sequence analysis confirmed the presence of the desired mutation. After sequencing, D111A mutants purified and ultracentrifuged to become more concentrated. Then enzyme activity assay performed and kinetic measurement of mutant determined. According to kinetic measurement Ser87A, Asp111A and His237A do not show the catalytic activity of the wild type esterase enzyme. These results indicate that, Ser 87, Asp111 and His 237 positions are part of the catalytic triad that is also called as an active side of the novel esterase enzyme. Secondly, in our previous experiments, mutations that were designed using the site saturation mutagenesis method were investigated with different analyses.Within the scope of previous studies, 300 mutations were obtained by saturation mutations in three different regions of the enzyme sequence. The amino acids at positions 121, 238, and 211 corresponding to histidine, tryptophan and tyrosine residues respectively were determined as the amino acids subjected to the site-saturation mutagenesis due to their proximity to the substrate binding site. The mutant cells (C43 Escherichia coli) were inoculated in Luria Bertani broth medium in triplicate to express the protein and then extracted by BugBuster extraction reagent. The accuracy of protein expression for randomly selected mutants was checked by SDS-PAGE and the thick-dark band was observed around 25-35 kDa which belongs to the molecular weight of the wild type esterase (28 kDa). The observed I band ensured to continue with the enzyme kinetic experiment. The activity test was carried out with wild type and all type of mutants. 4-Nitrophenyl hexanoate (6C) and 4-Nitrophenyl dodecanoate (12C) have been used as substrates to check the activity of both wild type and the mutants. As a result of the high purity of H121R, W238S, W238W and Y211A mutants with the highest absorbance value, the specific activities against 6C and 12C substrates were determined. When the results are compared to the activity of wild type esterase, the W238S mutant esterase enzyme has been observed to have the same activity as wild type esterase against the 6C and 12C substrates compared to other mutants.
Benzer Tezler
- Protein engineering applications of novel esterase enzyme using rational design and directed evolution approaches
Rasyonel tasarım ve yönlendirilmiş evrim yaklaşımlarıyla yeni esteraz enziminin protein mühendisliği uygulamaları
ŞEYMA YILMAZ KÜPOĞLU
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyomühendislikİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
- Protein engineering applications on industrially important enzymes
Endüstriyel öneme sahip enzimlerin protein mühendisliği uygulamaları
GÜLŞAH ÖZGÜN
Doktora
İngilizce
2019
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
- Protein engineering applications for functional enhancement of cellulase and lipase enzymes
Lipaz ve selülaz enzimlerinin fonksiyonel özelliklerinin protein mühendisliği uygulamaları ile arttırılması
ASLI YENENLER
- A novel structural protein-protein interaction network model: Its applications on drug off-target prediction and genotype-phenotype linkage
Yeni bir yapısal protein-protein etkileşimi ağ modeli: Bu modelin ilaç uzak-hedeflerinin tahmininde ve genotip-fenotip bağlantısı kurmaktaki uygulamaları
HATİCE BİLLUR ENGİN ARAS
Doktora
İngilizce
2013
Bilgisayar Mühendisliği Bilimleri-Bilgisayar ve KontrolKoç ÜniversitesiBilgisayar Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ATTİLA GÜRSOY
PROF. DR. ZEHRA ÖZLEM KESKİN ÖZKAYA
- Biyomedikal uygulamalar için kendi kendini onaran yenilikçi malzemelerin geliştirilmesi ve karakterizasyonu
Development and characterization of novel self-healing materials for biomedical applications
DİLARA YILMAZ AYKUT
Doktora
Türkçe
2023
Kimya Mühendisliğiİstanbul Üniversitesi-CerrahpaşaKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HÜSEYİN DELİGÖZ
DR. ÖĞR. ÜYESİ AYÇA BAL ÖZTÜRK