Investigation of the effect of valproic acid, an hdac inhibitor, on the relationship between oxidative stress and autophagy in human eosinophil
İnsan eosinofillerinde valproik asit ile oluşturulan oksidatif stres ve otofaji sonrası bağışık yanıtların incelenmesi
- Tez No: 730195
- Danışmanlar: DOÇ. DR. CEREN ÇIRACI
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Allerji ve İmmünoloji, Allergy and Immunology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 87
Özet
Epigenetik, fenotip ve genotip arasında köprü görevi görmektedir. DNA dizisinde herhangi bir değişiklik olmaksızın gen aktivitesini modüle eden her işleme epigenetik modifikasyon denir. Epigenetik modifikasyonlar 3 ana gruba ayrılır: histon modifikasyonları, DNA metilasyonu ve kodlamayan RNA'lar. Bu değişiklikler geri dönüşümlüdür çünkü DNA dizisinde bir değişikliğe neden olmazlar. Bununla birlikte, modifikasyonlardaki düzensizlik, kanser, metabolik ve nörolojik bozukluklar gibi çeşitli hastalıklara yol açabilir. DNA metilasyonu, histon deasetilaz, histon asetil transferaz ve protein metiltransferaz gibi epigenetik modifikasyonları inhibe eden inhibitörler, hastalıkların patogenezini yönlendiren epigenetik süreçleri tersine çevirmek için geliştirilmiştir. Tedavilerde epigenetik ilaçlar olarak kullanılmakta olup en yaygın olarak kullanılan inhibitörlerden biri histon deasetilasyon inhibitörleridir (HDACi). Valerik asitten elde edilen dallı kısa zincirli bir yağ asidi olan valproik asit (VPA), HADCi olarak kullanılan ilaçlardan biridir. VPA genellikle epileptik nöbetler, migren ve bipolar bozukluk gibi farklı hastalık türlerinin etkin tedavisinde antikonvülzan ilaç olarak kullanılmaktadır. Ek olarak, bir HDAC inhibitörü olarak VPA, kanser tedavisinde etkili olma ve alerjik tepkileri kontrol etme konusunda umut verici bir potansiyele sahiptir, çünkü anti-tümör immünitesinde ve hücrelerin aktivasyonunda yer alan önemli genlerin ekspresyonuna aracılık edebildiği gösterilmiştir. Bununla birlikte, çalışmalar terapötik olarak kullanıldığında bile farklı hücrelerde, VPA'nın bir yan etki olarak oksidatif stresi indüklediğini ve otofaji yolunu, inflamatuar yanıtı aktive edebileceğini ortaya koymuştur. Bu tezde amacımız öncelikle valproik asit kaynaklı stresin Eol-1 hücrelerinde homeostasiyi sağlayan antioksidan yol, inflamatuar kompleksler ve otofaji yollarının aktivasyonu üzerindeki etkilerini araştırmaktır. Eol-1 insan eozinofilik hücreleri, eozinofillerin alerjik reaksiyonlara yanıtta anahtar bir rolü olması nedeniyle bu çalışmada kullanılmıştır. Hücrede reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretiminin dengesi bozulduğunda hücrelerde oksidatif stres ortaya çıkar. ROS'lar oldukça reaktif moleküllerdir, bu nedenle yüksek ROS seviyeleri hücre bileşiklerine zarar verebilir. Bu yüzden, reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunun düzenlenmesi, hücrelerin düzgün çalışması için çok önemlidir. Homeostazı sürdürmek için hücreler, oksidatif stresin neden olduğu toksisiteyi azaltmak için bir dizi antioksidan tepki geliştirir. Bu durumda hücredeki ana düzenleyici antioksidan transkripsiyon faktörü nükleer faktör eritroid 2-ilişkili faktör 2'dir (Nrf2). Normal koşullar altında, Nrf2, sitoplazmada Kelch benzeri ECH ile ilişkili protein 1 (Keap1) ile etkileşime girer ve Nrf2'nin 26s proteazomu tarafından bozulmasına yol açar, bu nedenle Nrf2'nin negatif düzenleyicisidir. Oksidatif stres ise Keap1'de Nrf2 ve Keap1'in ayrışmasına yol açan konformasyonel bir değişikliğe neden olur. Bu ayrışma, Nrf2'nin asetilasyonunu ve nükleer translokasyonunu arttırır. Nrf2 tarafından transkribe olan proteinler, oksidatif stresin neden olduğu aşırı bağışıklık tepkilerini inhibe etmek için hücrede hem anti-inflamatuar hem de pro-inflamatuar yolların aktivasyonunda yer alır. Sonuçlarımız, 24 saatlik VPA stimülasyonunun, Eol-1 hücrelerinin canlılığında herhangi bir değişiklik olmaksızın doza bağımlı bir şekilde hücresel ROS oluşumunu arttırdığını gösterdi. Ayrıca, aktivasyon markörü CD69, VPA tedavisi yoluyla doza bağlı bir şekilde yukarı regüle edildi. VPA, başlangıç dozlarında Nrf2'nin protein seviyesini ve asetillenmiş Nrf2'yi arttırırken, Keap1 protein seviyesini doza bağlı bir şekilde zayıflattı. Bağışıklık sistemi, mikroorganizmaların aşırı reaksiyonu ve istilası yoluyla çeşitli patojenler veya hastalıklarla savaşmak ve konağın homeostazını korumak için bir savunma ağı oluşturmak üzere bir araya gelen hücreleri, dokuları, organları ve bileşenleri temsil eder. Bağışıklık sistemi iki gruptan oluşur: doğuştan gelen bağışıklık ve adaptif bağışıklık. Patojenlere karşı ilk savunma, doğuştan gelen bağışıklık ile sağlanır ve doğal bağışıklıkta ana efektör hücreler granülositler (bazofiller, mast hücreleri, eozinofiller, nötrofiller), monositler ve Langerhans hücreleri gibi beyaz kan hücreleridir. Doğuştan gelen bağışıklık tepkisi, zar/sitoplazmik reseptörler, inflamatuar proteinler, salgılanan sitokinler ve kemokinler tarafından kontrol edilir. Patern tanıma reseptörleri (PRR'ler) temel olarak Toll benzeri reseptörler (TLR), NOD benzeri reseptörler (NLR), C tipi Lektin (CLR) ve RIG-I benzeri reseptörler (RLR) olarak sınıflandırılır. Farklı patojen bağlantılı moleküler kalıpları (PAMP'ler) ve tehlikeyle ilişkili moleküler kalıpları (DAMP'ler) tanıyabilirler. Ligand-reseptör etkileşimi, inflamatuar yanıtları başlatır. Başlıca kanonik inflamatuar yanıtlar, bakteri, mitokondriyal ROS ve ATP gibi mikrobiyal yapılara ve tehlike sinyallerine karşı NLRP3, NLRC4 inflamatuar kompleksleri tarafından yönlendirilir. NLRP3 ve NLRC4 proteinleri, ASC ve kaspaz 1 ile ayrı ayrı biraraya gelerek kompleks oluşturur. Aktive edilmiş kaspaz-1, IL-1β, IL-18 ve gastermin D'nin (GSDMD) pro formlarını olgun formlara dönüştürür. İlk olarak, GSDMD oligomerize olur, ardından gözenekler oluşturmak için zara göç eder, böylece gözeneklerden olgun sitokinler salınabilir. Hücre zarı bütünlüğü bozulur ve hücreler sonunda ölür; bu sürece piroptoz denir. Sitokinlerin ve kemokinlerin salınımı, mikrobiyal savunmada uygun bağışıklık tepkisi için önemli olan birçok inflamatuar hücrenin göçünü ve aktivasyonunu indükler. Bulgularımıza göre, VPA tedavisi NLRC4'ün protein seviyesini doza bağlı olarak azalttı, ancak ilginç bir şekilde NLRP3 ve kaspaz-1 bölünmesi, olgun formdaki IL-1β protein seviyeleri Eol-1 hücrelerinde başlangıç dozlarında yükseldi. IL-1β olgunlaşması, kaspaz-1 ve inflamatuar kompleksin aktivitesi ile doğru orantılı olarak arttı. Olgunlaşmış IL-1β artmasına rağmen, VPA stimülasyonu yoluyla IL-1β ve IL-10 salgılanması önemli değişmedi. Otofaji, hücrede çeşitli streslere karşı homeostazın korunmasından sorumlu bir mekanizmadır. Hücreler, besin eksikliği veya yüksek seviyelerde reaktif oksijen türleri (ROS) gibi hücresel streslere yanıt olarak lizozomal bozunma yoluyla hasarlı ve gereksiz hücre bileşenlerini uzaklaştırır. En çok çalışılan otofaji türü olan makrootofajide sitoplazmik bileşenler, otofagozom adı verilen veziküller yardımıyla lizozom ile birleşerek otolizozom yapıları oluşturur ve otofagozom içindeki bileşenler degrade edilir. Otofajinin sürdürülmesinde çeşitli genler/proteinler ve yollar yer alır. MAPK (mitojenle aktive olan protein kinaz), Akt (alfa serin/treonin-protein kinaz) ve mTOR (rapamisinin memeli hedefi) yolları, otofaji yolunun yukarısında yer alırlar ve hücre büyümesi, hücresel metabolizma, hücrenin hayatta kalması ve hücre çoğalması gibi hücresel faaliyetlerin düzenlenmesinde etkilidirler. ERK1 / 2, otofagozom varlığında fosforile edilir ve bu nedenle otofaji aktivasyonunda pozitif bir belirteç olarak kullanılabilir. Tersine, Akt ve mTOR yolları, otofaji yolunu negatif olarak düzenler. Akt sinyal yolunun fosforilasyonu, mTOR, Akt'nin akış aşağısında olduğu için mTOR yolunun aktivasyonunu da etkiler. Bunlara ek olarak, mikrotübülle ilişkili protein hafif zincir 3 (LC3), otofaji akışındaki ana belirteçti. Otofaji activasyonuyla sitosolik form LC3-I, LC3-II formuna dönüştürülür. LC3-II, otofagozomların ve preotofagosomal yapının (PAS) iç ve dış zarına bağlanır. Diğer bir yandan Beclin 1, otofagozom yapısı için çok önemli olduğu ve ERK aktivitesini indüklerken mTOR aktivitesini baskıladığı için otofaji aktivasyonu için bir işaret olarak kullanılır. Bulgularımız, VPA stimulasyonuyla, p44/42 MAPK (ERK1/2) proteininin doza bağlı olarak arttığını ve başlangıç dozlarında p44 MAPK fosforilasyonunun yukarı doğru düzenlendiğini gösterdi. Öte yandan, Akt'nin protein seviyesi VPA ile değişmezken, Akt'nin hem serin 473 hem de treonin 308 üzerindeki fosforilasyonu, VPA stimülasyonu yoluyla aşağı regüle edildi. Ayrıca, VPA dozlarındaki artışa bağlı olarak mTOR protein seviyesi ve mTOR fosforilasyonu azaldı. LC3B II'nin protein seviyesi VPA stimülasyonu ile arttı. Bununla birlikte, artan VPA seviyeleri, Beclin-1 protein seviyesini zayıflattı. Sonuçlarımız, VPA stimülasyonunun, Eol-1 hücrelerinde Beclin 1'dan bağımsız olarak otofaji yolunu indüklediğini gösterdi. Mevcut verilerimize dayanarak, VPA, ROS üretim seviyelerini artırarak oksidatif strese neden olurken, Eol-1 hücrelerinde antioksidan transkripsiyon faktörü NRF2'yi aktive etti. Ayrıca VPA, Eol-1 hücrelerinin aktivasyonunu arttırdı. VPA, proinflamatuar sitokinlerin salgılanmasında herhangi bir değişiklik olmaksızın inflamatuar kompleks oluşumunu indükledi. Son olarak, Eol-1 hücrelerinde Beclin1'den bağımsız olarak otofaji yolunu aktive etti. Elde ettiğimiz bu sonuçlar, VPA'nın terapötik kullanımında göz önünde bulundurulması gereken yan etkileri ortaya koymaktadır. Ayrıca VPA'nın Eol-1 hücrelerinin aktivasyonunu arttırması, alerjik yanıtlarda reaksiyonun şiddetinin arttırılması istenmediği için VPA'nın ilaç olarak kullanılıp kullanılamayacağı sorusunu gündeme getirmektedir.
Özet (Çeviri)
Epigenetics bridges the gaps between phenotype and genotype. Any process that modulates the gene activity without causing any change in DNA sequence is called epigenetic modification. Epigenetic modifications are divided into three main groups: histone modifications, DNA methylation, and non-coding RNAs. These changes are reversible because they do not alter DNA sequence. However, dysregulation in modifications can lead to several diseases such as cancer, metabolic, and neurological disorders. Inhibitors that suppress modifications such as DNA methylation, histone deacetylase, histone acetyl transferase, and protein methyltransferase have been developed to reverse the epigenetic processes that drive the pathogenesis of diseases and are used as epigenetic drugs for treatments. One of the most widely used inhibitors in therapy is histone deacetylation inhibitors (HDACi). Valproic acid (VPA), a branched short-chain fatty acid obtained from valeric acid, is one of the drugs used as HDACi. VPA is generally used as an anticonvulsant drug for the effective treatment of different types of diseases such as epileptic seizures, migraine headaches, bipolar disorder. In addition, VPA has the promising potential to be effective in cancer therapy and controlling allergic responses because it can mediate the expression of important genes involved in anti-tumor immunity and activation of cells. Nevertheless, even when VPA is used therapeutically, studies have revealed that VPA induces oxidative stress, and can activates autophagy pathway, inflammasome response in different cells as a side effect. In this thesis, our aim is primarily to investigate the effects of valproic acid-induced stress on the activation of the antioxidant pathway, inflammasome complexes, and autophagy pathways that maintain cell balance in Eol-1 cells. Eol-1 human eosinophilic cells were used in this study since eosinophils have a key effector role in the response to allergic reactions. When the balance of reactive oxygen species (ROS) production in the cell is disrupted, oxidative stress arises in cells. ROS are highly reactive molecules and, elevated levels of ROS can damage cell compounds. Therefore, regulation of reactive oxygen species (ROS) generation is crucial for the proper functioning of cells. To maintain homeostasis, cells develop a series of antioxidant responses to reduce the toxicity caused by oxidative stress. In this case, the main regulator in the cell is the antioxidant transcription factor nuclear factor erythroid 2-associated factor 2 (Nrf2). Under normal conditions, Nrf2 interacts with Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1) in the cytoplasm and leads to degradation of Nrf2 by the 26s proteasome, thus it is a negative regulator of Nrf2. Oxidative stress causes a conformational change in Keap1, leading to the dissociation of Nrf2 and Keap1. This enhances the acetylation and nuclear translocation of Nrf2. Proteins which transcribed by Nrf2 are involved in the activation of both anti-inflammatory and pro-inflammatory pathways in the cell to inhibit excessive immune responses caused by oxidative stress. Our results showed that VPA stimulation increased the cellular ROS formation in a dose-dependent manner at 24 h post-stimulation without any change in viability of Eol-1 cells. Moreover, the activation marker CD69 was upregulated via VPA treatment in dose-dependent manner. At lower concentrations, VPA augmented the protein level of Nrf2 and acetylated Nrf2, while attenuating the protein level of Keap1 in a dose-dependent manner. The immune system represents cells, tissues, organs, and components that come together to form a defense network to fight various pathogens or diseases by the excessive reaction and invasion of the microorganisms and to maintain the homeostasis of the host. The immune system consists of two arms: innate immunity and adaptive immunity. The first defense against pathogens is provided by innate immunity and white blood cells such as granulocytes (basophils, mast cells, eosinophils, neutrophils), monocytes, and Langerhans cells which are the main effector cells in innate immunity. The innate immune response is controlled by membrane/cytoplasmic receptors, inflammatory proteins, secreted cytokines, and chemokines. Pattern recognition receptors (PRRs) are mainly categorized as Toll-like receptors (TLR), NOD-like receptors (NLR), C-type Lectin (CLR) and RIG-I-like receptors (RLR). They can recognize different pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and danger associated molecular patterns (DAMPs). Ligand-receptor interaction initiates inflammatory responses. The major canonical inflammatory responses are driven by NLRP3, NLRC4 inflammasome complexes against microbial structures and danger singals such as bacteria, mitochondrial ROS, and ATP. The NLRP3 and NLRC4 proteins combine with ASC and caspase 1 separately to form complexes. Activated caspase-1 cleaves pro forms of IL-1B, IL-18, and gastermin D (GSDMD) into mature forms. Firstly, GSDMD oligomerizes, then migrates to the membrane to form pores, so mature cytokines can be released from the pores. Cell membrane integrity is disrupted, and cells eventually die; this process is called pyroptosis. The release of cytokines and chemokines induces the migration and activation of many inflammatory cells, which is important for the proper immune response in microbial defense. According to our findings VPA treatment reduced the protein level of NLRC4 in a dose dependent fashion, but interestingly NLRP3 and caspase-1 cleavage, cleaved IL1β protein levels were elevated at lower doses in Eol-1 cells. IL-1B cleavage increased in parallel to the activity of caspase-1 and the inflammasome complex. Although cleaved IL1B was increased intracellularly, IL-1B and IL-10 secretion via VPA stimulation did not significantly change as compared to non- treated group. Autophagy is a mechanism responsible for maintaining homeostasis in the cell under various stress conditions. Cells remove damaged and unnecessary cell components through lysosomal degradation in response to cellular stresses such as nutrient deficiency or high levels of reactive oxygen species (ROS). As the most studied autophagy type, in macroautophagy, cytoplasmic components merge with the lysosome with the help of vesicles called autophagosome, forming autolysosome structures and the components inside the autophagosome are degraded. Various genes/proteins and pathways are involved in the maintenance of autophagy. The MAPK (mitogen-activated protein kinase), Akt (alpha serine/threonine-protein kinase) and mTOR (mammalian target of rapamycin) pathways are in the upstream of the autophagy pathway and are responsible for the regulation of cell growth, cellular metabolism, cell survival, and proliferation of cells. ERK1/2 is phosphorylated in the presence of autophagosome and thus it can be used as a positive marker in the autophagy pathway. Conversely, Akt and mTOR pathways negatively regulate the autophagy pathway. Phosphorylation of the Akt signaling pathway affects activation of the mTOR pathway as mTOR is downstream of Akt. In addition to these, microtubule‑associated protein light chain 3 (LC3) is the main marker in the autophagy flux. The cytosolic form LC3-I is converted to the LC3-II form through autophagy activation. LC3-II binds to the inner and outer membrane of the autophagosomes and preautophagosomal structure (PAS). Also, Beclin 1 is used as a marker for autophagy activation because it is crucial for the autophagosome structure and suppresses mTOR activity while inducing ERK activity. Our findings indicated that following VPA treatment, p44/42 MAPK (ERK1/2) protein increased at ascending doses, and phosphorylation of p44 MAPK was upregulated at lower doses. On the other hand, while the protein level of Akt didn't change after VPA, phosphorylation of Akt on both serine 473 and threonine 308 was downregulated via VPA stimulation. Moreover, the mTOR protein levels and the phosphorylation of mTOR decreased at high VPA doses, while protein levels of LC3B II was increased by VPA stimulation. However, increasing concentrations of VPA decreased the Beclin-1 protein level. Our results suggest that VPA stimulation induced the autophagy pathway independently of Beclin1in Eol-1 cells. Based on our current data, VPA led to oxidative stress by increasing ROS production levels and activated the antioxidant transcription factor NRF2 in Eol-1 cells. Also, VPA activated Eol-1 cells. VPA induced inflammasome complex formation without any change in the secretion of proinflammatory cytokines. Finally, VPA activated the autophagy pathway independently of Beclin1 in Eol-1 cells. Our results demonstrated the side effects that should be considered in the therapeutic use of VPA. In addition, the fact that VPA increases the activation of Eol-1 cells raises the question of whether VPA can not be used as a drug in allergic responses since it is not desired to increase the severity of the reaction in allergic responses.
Benzer Tezler
- Valproik asit ve baicalein kombinasyonunun akciğer kanseri hücre soylarında sitotoksik/apoptotik etkilerinin araştırılması
Investigation of Cytotoxiıc/Apoptotic Effect of Valproic Acid andBaicalein Combination in Lung Cancer Cell Lines
VIDA REZAYIFAR
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
Biyolojiİstinye ÜniversitesiKanser Biyolojisi ve Farmakolojisi Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ NAZLIHAN AZTOPAL
- Kök hücre WNT yolak inhibitörü olan niklozamidin, histon deasetilaz inhibitörü (hdac) olan valproik asit ile kombinasyonlarının akciğer kanser hücreleri üzerindeki sitotoksik ve apoptotik etkilerinin araştırılması
Investigation of the cytotoxic and apoptotic effects on lung cancer cell lines with the combination of the histone deacetylase i̇nhibitor is valproic acid and niclosamide which is an inhibitor of WNT pathway in stem cell.
OĞUZHAN AKGÜN
- Pilokarpin indüklü sıçan epilepsi modelinde valproik asit'in NRF 2 ekspresyonu üzerindeki etkisinin araştırılması
An investigation of the effect of valproic acid on NRF 2 expression in pilocarpine induced rat epilepsy model
ESİN KURT
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
Genetikİstanbul ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MÜJGAN CENGİZ
- Valproik asit ve spironolakton kombinasyonunun akciğer kanseri hücre soylarında sitotoksik/apoptotik etkilerinin araştırılması
Investigation of cytotoxic/apoptotic effects of valproic acid and spironolactone combination on lung cancer cell lines
MEHMET EMİN KÖSE
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
Biyolojiİstinye ÜniversitesiKanser Biyolojisi ve Farmakolojisi Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ NAZLIHAN AZTOPAL
- Pentilentetrazol ile oluşturulmuş in vitro nörotoksisite modelinde trpm2 katyon kanalı aracılığı ile valproik asit etkisinin araştırılması
Investigation of valproic acid effect via trpm2 cation channel in a pentylenetetrazole-induced in vitro neurotoxicity model
ADEM AHLATCI
Doktora
İngilizce
2023
Biyofizikİstanbul ÜniversitesiBiyofizik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MUHAMMET BEKTAŞ
PROF. DR. YASİN TÜLÜCE