Expression, purification, and characterization of soluble recombinant TNFR1
Çözünür rekombinant TNFR1'in üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
- Tez No: 737961
- Danışmanlar: PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biyoteknoloji, Genetik, Biology, Biotechnology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 97
Özet
Tümör Nekroz Faktör Alfa (TNF-α), makrofaj ve monositler tarafından salınan trimerik bir sitokindir. Tip II transmembran protein ailesinden olup doğuştan ve adaptif bağışıklıkta görev alır. TNF-α 'nın çözünür ve transmembran olmak üzere iki formu bulunmaktadır. Transmembran TNF (tmTNF) öncül form olarak sentezlenmektedir ve tmTNF işlenerek çözünür (sTNF) hale getirilir. TNF-α, biyolojik işlevlerinin birçoğunu spesifik reseptörlerle (TNFR1, TNFR2) etkileşerek gerçekleştirir. TNFR1, intraselüler, transmembran ve ekstraselüler olmak üzere üç bölümden oluşmaktadır. Ekstraselüler kısmı ise sisteince zengin dört bölümden oluşur. TNF-α, TNFR1'in ekstraselüler kısmına bağlanarak inflamasyon, apoptoz gibi çeşitli sinyal yolaklarını aktifleştirebilmektedir. Normalde sağlıklı bireylerde TNF-α seviyesi tespit edilemezken, inflamasyon koşullarında serum ve dokuda artan TNF-α, tespit edilebilir duruma gelmektedir. Bununla birlikte TNF-a seviyesindeki artışla inflamasyon arasında korelasyon bulunmaktadır. TNF-α'nın kontrollü üretimi doku iyileşmesi ve enfeksiyon ile mücadele için gerekli olmasına karşın TNF-α seviyesinin sürekli yüksek olması Romatoid artrit (RA), ankilozan spondilit (AS), psoriasis/psoriatik artrit, Chron hastalığı gibi çeşitli hastalıklara sebep olabilmektedir. Son zamanlarda hedefe yönelik seçicilikleri ve yüksek afinitelerinden dolayı biyoterapötikler diğer terapötiklere nazaran daha çok tercih edilmektedir. Hücre içerisinde hayati rollere sahip olan TNF-α'nın aşırı ekspresyonu sonucu oluşan hastalıkların tedavisi için TNF-α inhibitörleri tasarlanmakta ve tedavide kullanılmaktadır. Ayrıca, aşırı eksprese edilen TNF-a'nın etkilerinin engellenmesi için TNFR1'in ekstraselüler domaini biyoterapötik bir araç olarak kullanılmaktadır. TNFR1'in ekstraselüler kısmı gibi biyoteknolojik değere sahip bu sisteince zengin proteinlerin üretiminde bakteriyel sistemlerin kullanılması maliyet, üretim hacmi ve zaman açısından avantajlıdır. Ancak E. coli'de etkili bir translasyon sisteminin olmaması disülfit bağı içeren proteinlerin üretiminde engel teşkil etmektedir. Sistein kalıntılarının yanlış eşleşmesi ya da eşleşememesinden dolayı proteinler agrege olarak inklüzyon cisimcikleri oluşturmaktadır. İnklüzyon cisimciklerinden protein geri kazanılması sırasında kayıplar yaşanmakta ve yeniden katlama sürecinde proteinin yapısında olmayan ya da yanlış oluşturulmuş disülfit bağ görülebilmektedir. Bu nedenle inklüzyon cisimciklerinden proteinin geri kazanım stratejileri zahmetli, zaman alıcı ve pahalı bir süreçtir. Bakterilerde disülfit bağlarının oluşmasından Dsb protein ailesi sorumludur. Başlıca Dsb proteinleri: DsbA, DsbB, DsbC, DsbD ve DsbG'dir. Bakterilerde DsbA-DsbB oksidatif yolağı ve DsbC-DsbD izomerizasyon yolağı bir arada bulunur. xxviii DsbA ve DsbC periplazmik proteinler olup DsbB ve DsbD ise transmembran proteinlerdir. Disülfit bağlarının oluşturulmasında DsbA görev alır. Çözünür ve yüksek oranda oksitleyici bir protein olan DsbA hızlı ama spesifik olmayan bir şekilde bağ kurduğu için yanlış katlanmış disülfit bağları oluşturabilmektedir. DsbB ise DsbA'nın uygun formda (oksitlenmiş formda) bulunmasını sağlamaktadır. DsbA tarafından kurulan yanlış disülfit bağlarının düzeltilmesinde DsbC sorumludur. DsbC bir izomeraz olup aynı zamanda şaperon aktivitesine sahiptir. DsbD ise DsbC'nin indirgenmiş formda tutulmasını sağlamaktadır. Dsb proteinleri arasında DsbA ve DsbC en kapsamlı şekilde incelenmekte ve biyoteknoloji alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. Önceki çalışmalarımız, TNFR1'in ekstraselüler kısmının E. coli'de inklüzyon cisimciği oluşturduğunu ve doğru konformasyonun elde edilmesi için in vitro olarak yeniden katlama adımlarına ihtiyaç olduğunu gösterdi. Yeniden katlama sürecinde gerçekleşen protein agregasyonları verimin düşmesine de neden olmuştur. Bu çalışmada, TNFR1'in ekstraselüler kısmının E. coli'de çözünür formda elde edilmesi hedeflenmiştir. Bu amaç doğrultusunda öncelikle konak hücre olarak genomunda sitoplazmik DsbC kopyasına sahip SHuffle T7 suşu seçilmiş ve ekspresyon denemeleri yapılmıştır. Ancak hedef proteinin inklüzyon cisimciği oluşturduğu tespit edilmiştir. Daha sonra TNFR1 ile DsbC füzyon proteini (DsbC-TNFR1) oluşturulmuştur. Füzyon proteini oluşturmak için tasarlanan plazmitte N ucundan C ucuna doğru sırasıyla 6X Histidin etiketi, DsbC TEV kesim bölgesi ve TNFR1 bulunmaktadır. Hedef proteini bakteri sitoplazmasında üretebilmek için DsbC geninden periplazma hedef sekansı çıkarılmıştır. Öncelikle DsbC dizisi içermeyen TNFR1 plazmitinin ve DsbC dizisi içeren TNFR1 plazmitinin ekspresyonu sağlanarak oluşturulan füzyonun işlevselliği kontrol edilmiştir. Ekspresyon seviyeleri SDS-PAGE ve immünoblotlama teknikleriyle kontrol edilmiş ve üretilen DsbC-TNFR1'in bir kısmının çözünür formda olduğu tespit edilmiştir. Daha sonra DsbC-TNFR1'in uygun formda üretilmesi için konak hücre seçimi yapılmıştır. Rosetta (DE3), Rosetta-gami 2, SHuffle T7, BL21 (DE3) ve C43 olmak üzere 5 farklı E. coli suşları kullanılarak proteinin ekpsresyonu denenmiştir. Rosatta-gami ve C43 suşlarında yeterli miktarda ekspresyon görülememiştir. Rosetta (DE3) suşundaki üretim diğerlerine göre daha yüksek olduğu için Rosetta (DE3) ile çalışmalara devam edilmiştir. Protein ekspresyonunu kontrol etmek için başlangıçta IPTG kullanılmıştır. Ancak sonrasında sürecin optimizasyonu için farklı inkübasyon sıcaklıkları, inkübasyon süreleri farklı indükleme yöntemleri (IPTG ya da oto indüksiyon) gibi parametreler denenerek en iyi ortam koşulu belirlenmiştir. Denemeler sonucunda otomatik indüksiyon metodu kullanılarak hedef protein çözünür formda elde edilmiştir. Sonikasyon ile hücreler patlatıldıktan sonra santrifüj yardımıyla supernatant kısım elde edilmiş ve konak hücrenin proteinlerinden rekombinant proteini ayırmak için afinite kromotografi yöntemi kullanılmıştır. Safsızlıkların giderilmesi için ikinci bir saflaştırma adımı olarak anyon değişim kromatografisi (AEX) yöntemi kullanılmıştır. Yapılan saflaştırmaların etkinliğini değerlendirmek için SDS-PAGE ve immünoblotlama metotları kullanılmıştır. Daha sonra kapiler elektroforez cihazı ile izoelektrik odaklama metodu kullanılarak saf proteinin izoelektrik noktası hesaplanmış ve saflık tayini metodu kullanılarak proteinin saflığı kontrol edilmiştir. DsbC- TNFR1 füzyon proteinin ikincil yapısı, dairesel dikroizm spektroskopisi ile analiz edilmiştir. xxix Mavi doğal poliakrilamit jel elektroforezi (BN-PAGE) kullanılarak elde edilen saf proteinin doğal (nativ) yapısı incelenmiştir. Proteinin dimer ve farklı oligomer yapılarda bulunduğu görülmüştür. LC/MS aracılığıyla intak kütle analizi yöntemi kullanılarak üretilen proteinin moleküler ağırlığı, peptit haritalama yöntemi kullanılarak amino asit sekansı belirlenmiştir. Proteinin fonksiyonel olduğunu göstermek için aşağı çekme deneyi (pull-down assay) yapılmıştır. Saf olarak elde edilen protein, sahip olduğu polihistidin etiketi aracılığıyla nikel bağlı agaroz rezine bağlanmış ve reseptörün ligandı olan TNF-α rezine bağlı reseptörün üzerine eklenerek inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrasında yıkama ve elüsyon yapılarak fraksiyonlar toplanmıştır. Deneyin sonunda elde edilen fraksiyonlar immünoblotlama yöntemiyle analiz edilmiştir. Reseptör için Histidin antikoru, ligand için ise TNF-α antikoru kullanılmıştır. Bağlanma deneylerinin sonucunda reseptörün TNF-α'ya bağlandığı görülmüştür. Yapılan deneylerin sonucunda, oluşturulan füzyon proteinin bakteride çözünür formda TNFR1 ekspresyonunda başarılı olduğu görülmüştür. Gerçekleştirilen alt akım prosesleri sonucunda elde edilen saf proteinin karakterizasyonu yapılmış ve TNFR1'in fonksiyonel olduğu belirlenmiştir.
Özet (Çeviri)
Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) is a trimeric cytokine secreted by macrophages and monocytes. It belongs to type II transmembrane protein family and is involved in both innate and adaptive immune system. TNF-α exists in two forms: transmembrane TNF (tmTNF), which is synthesized as a precursor form, and solubilized TNF (sTNF), which is created after further processing. TNF-α functions in a variety of biological processes by interacting with specific receptors namely as TNFR1 and TNFR2. TNFR1 consists of intracellular, transmembrane, and extracellular domains. The extracellular part consists of four cysteine-rich parts. When interacting to TNFR1, TNF-α can activate various signaling pathways for instance inflammation and apoptosis. TNF-α level is undetectable in normal individuals, yet under inflammation conditions the protein concentration in serum increases proportionally to the inflammation level in the body, thus making the protein detectable. Controlled production of TNF-α is crucial for tissue healing and fight against infection, but a constantly high level of TNF-α can cause various diseases including rheumatoid arthritis (RA), ankylosing spondylitis (AS), psoriasis/psoriatic arthritis, and Chron's disease. TNF-α inhibitors are designed and used in treatment of diseases caused by overexpression of TNF-α. An alternative pathway includes employment of TNFR1 extracellular domain as a biotherapeutic tool to inhibit the effects of overexpressed TNF-α. The latter approach seems to be way more preferred than other therapeutics due to its targetselectivity and high affinity. Production of proteins like TNFR1 are characterized by cysteine-rich domains by using bacterial systems is quite advantageous in terms of cost, yield, and time. However, lack of an effective translation system in Escherichia coli (E. coli) may hinder production of such disulfide bond containing proteins mainly in terms of generating mismatched cysteine residues or failing in acquiring a sulfide bridge formation thus leading to protein aggregation and inclusion body formation. Recovering proteins from inclusion bodies is time-consuming and expensive while considering the protein loss and incorrectly folded proteins due to the wrongly formed disulfide bonds. Dsb protein family including DsbA, DsbB, DsbC, DsbD, and DsbG, is responsible for the formation of disulfide bonds in bacteria. The DsbA-DsbB complex plays role in the oxidative pathways, while DsbC-DsbD complex functions in the isomerization pathway. Among all Dsb proteins, DsbA and DsbC are the most extensively studied and widely used in the field of biotechnology. Our previous studies showed that the extracellular portion of TNFR1 forms inclusion bodies in E. coli, and in vitro refolding steps are needed to obtain the correct xxvi conformation. Protein aggregations during the refolding process also caused a decrease in yield. The purpose of this study is to obtain the extracellular part of TNFR1 as a soluble protein in E. coli. Initially, a SHuffle T7 strain with a cytoplasmic DsbC copy was selected as the host cell and expression experiments were carried out accordingly. However, the target protein formed an inclusion body. To assess the effect of DsbC in the correctly folded-soluble TNFR1 production, a expression vector containing fusion protein DsbC-TNFR1 was constructed. Formation of DsbC-TNFR1 fusion protein was held on the basis of plasmid design conferring the order of a 6x histidine tag, DsbC, TEV cleavage site, and TNFR1 from N to C terminus respectively. It was assured that periplasm target sequence was removed from DsbC gene, allowing its production within the bacterial cytoplasm. DsbC-TNFR1 production was verified by SDS-PAGE and immunoblotting analyses, which revealed that some conditions led to the production of the fusion protein in soluble form. In order to detect the optimum conditions to produce DsbC-TNFR1, four different E. coli strains as host cells were employed, namely as Rosetta (DE3), Rosetta-gami 2, SHuffle T7, and BL21 (DE3). However, since production of the Rosetta (DE3) strain was higher than others, the research was conducted on that particular strain. Induction conditions including IPTG induction and autoinduction medium were also assessed to get higher yield from the selected cells. As a result of induction trials, the target protein was obtained in soluble form when autoinduction was utilized. Following sonication and centrifugation of the cells, the affinity chromatography was performed for separation of the recombinant protein from other host cell proteins. Anion exchange chromatography (AEX) was used as a second purification step to remove remaining impurities. The efficiency of purification was evaluated by using SDS-PAGE and immunoblotting analyses. Then, protein characterization studies were performed. The isoelectric point of the pure protein was calculated by isoelectric focusing via capillary electrophoresis device, and the purity of the protein was checked using the purity determination method. The secondary structure of the fusion protein was analyzed by circular dichroism spectroscopy and it was determined to be in the α-helix structure. Intact mass analysis through LC/MS was also performed to calculate the molecular weight of the protein. In addition, the peptide mapping was used to identify the amino acid sequence. The native structure of the pure protein was investigated by using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE), which revealed that the protein exists in both dimers and different oligomer structures. The functionality of the fusion protein was assessed by performing a pull-down assay, which showed that DsbC-TNFR1 is functional as it was capable of binding to TNFR1 ligand TNF-α. As a consequence of the research, it was revealed that the implementation of such a fusion protein is a successful tool for expressing TNFR1 in its soluble form in bacterial cells. After analysis of the pure protein generated as the outcome of downstream steps, it was shown that the TNFR1 produced by using the implemented fusion method is functional.
Benzer Tezler
- Recombinant expression, purification and characterization of TNFR1
TNFR1'in rekombinant üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
YAĞMUR ÖZ
Yüksek Lisans
İngilizce
2020
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Prolil endopeptidaz (PEP) enziminin Escherichia coli ekspresyon sisteminde çözünür formda eldesi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Obtaining, purification and characterization of soluble form of prolyl endopeptidaze (PEP) enzyme in Escherichia coli expression system
NEJLA BAKIR
Yüksek Lisans
Türkçe
2020
BiyomühendislikTokat Gaziosmanpaşa ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. İSA GÖKÇE
- Expression, purification and characterization of high-fidelity DNA polymerase
Yüksek-duyarlı DNA polimeraz enziminin üretilmesi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
KÜBRA TÜRK
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Metagenomik yaklaşımla elde edilen endoglukanaz enziminin rekombinant ekspresyonu ve karakterizasyonu
Recombinant expression and characterization of a novel endoglucanase enzyme obtained by metagenomics approach
FURKAN ABDULLAH ÇALIŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyoteknolojiYıldız Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ EMEL ORDU
DR. GÜNSELİ KURT GÜR
- Recombinant production and characterization of serine protease enzyme from Virgibacillus sp. AGTR strain using site directed mutagenesis
Virgibacillus sp. AGTR suşundan izole edilen serin proteaz enziminin bölgeye yönelik mutagenez yöntemi kullanılarak rekombinant üretimi ve karakterizasyonu
EVRİM KAPUCU
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
Biyokimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER