Expression, purification and characterization of high-fidelity DNA polymerase
Yüksek-duyarlı DNA polimeraz enziminin üretilmesi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
- Tez No: 783309
- Danışmanlar: PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 81
Özet
DNA polimerazlar günümüze dek keşfedilen bütün canlı hücrelerde bulunan, şablon DNA'ya komplementer yeni bir DNA zinciri sentezlenmesinde görevli bir enzimdir. Bu enzim, hücre bölünmesi sırasında genetik bilginin nesiller boyunca taşınmasında büyük bir rol oynarken, günümüz in-vitro tanı tekniklerinin en önemlilerinden olan Polimeraz Zincir Reaksiyonu'nun (PZR) da temelini oluşturmaktadır. PZR, uzun zaman önce ortaya çıkmış ve biyoteknolojinin temel tekniklerinden biri olarak yerini almıştır. DNA polimerazlar, türler arasında korunan bir deoksiribonükleotit zincirini sentezleme yeteneğinin yanı sıra işlenebilirlik, aslına uygunluk (sentez doğruluğu) ve nükleotit seçiciliği gibi yeteneklere de sahip olabilirler. Bu yeteneklerine göre bazı polimerazlar, yüksek hata oranına sahip olmalarından kaynaklı, rastgele mutasyonlar gerçekleştirmek amacıyla kullanılırken, bazıları ise çok düşük hata oranına sahip olup, şimdiye kadar gerçekleştirilen en büyük çalışmalardan biri olan İnsan Genom Projesi gibi araştırmalarda kalıp DNA'yı olabilecek en düşük hata oranıyla çoğaltmak için kullanılır. PZR temelli çalışmalarda kullanılan enzimlerin stabilitesinin, sıcaklığa bağlı olarak azalmaması yüksek önem arz ettiğinden çoğunlukla termostabil DNA polimeraz enzimleri tercih edilmektedir. Termostabil DNA polimerazlar arasında ilk keşfedilen ve en ünlü olanı Thermus aquaticus'tan izole edilen Taq DNA polimerazıdır. Taq polimerazı takiben hipertermofilik arkelerden elde edilen DNA polimerazlar da PZR çalışmalarında kullanılmaya başlanmıştır. Yüksek duyarlı DNA polimeraz da 1991 yılında keşfedilen ve yüksek termofilik özellik gösteren bir DNA polimerazdır. Klonlama gibi yüksek doğruluk gerektiren uygulamalarda düzeltme aktivitesine (proofreading) sahip yüksek duyarlı DNA polimeraz gibi DNA polimerazlar yaygın olarak kullanılmaktadır. Yüksek duyarlı DNA polimeraz, 775 amino asit uzunluğunda, yaklaşık 90 kDa moleküler ağırlığa sahip bir enzimdir. Bu enzim, DNA sentezi sırasında yapıya eklenen yanlış nükleotidlerin yapıdan çıkarılarak doğrusunun eklenmesini sağlayan 3'-5' düzeltme okuması gerçekleştirebilmektedir. Bu özelliği sayesinde sentez sırasındaki hata oranını azaltmaktadır (1.3×10-6 mutasyon/baz çifti/duplikasyon). Bu da Taq DNA polimeraz ile karşılaştırıldığında yaklaşık 8 kat daha az hata yaptığını gösterir. Birçok araştırmacı, bu proteini hipertemofilik bir arke olan Pyrococcus furiosus'tan Escherichia coli'nin farklı suşlarına klonlayarak üretimini gerçekleştirmiştir. Proteinin biyofiziksel özellikleri ve klonlama sırasında eklenen afinite etiketlerinden yola çıkarak ise afinite kromatografisi veya iyon değişim kromatografisi ile saflaştırma protokolleri oluşturulmuştur. Bu çalışmada yüksek duyarlı DNA polimeraz enziminin yüksek verimle, düşük maliyetli bakteriyel üretiminin ardından termal stabilitesi ve 10X Polihistidin etiketinden yararlanılarak saflaştırılması ve karakterizasyonunun yapılması amaçlanmıştır. Çalışmada, ticari olarak satın alınan N-ucunda 10X Polihistidin etiketi bulunan pET16B plazmit DNA kullanılmıştır. pET16B plazmiti, GroEL/GroES şaperoninlerini içeren kompetent E. coli BL21(DE3) hücrelerine transforme edilerek proteinin ifadesi sağlanmıştır. Termostabil bir protein olan yüksek duyarlı DNA polimeraz'ın saflaştırmasının ilk adımında, bakteri hücrelerinden katlanmış formda elde edilen tüm proteinler ısıtılmış ve santrifüjlenerek termal stabilitesi daha az olan safsızlıklar ayrılmıştır. Çözünür formda olan yüksek duyarlı DNA Polimerazı IMAC afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırılmıştır. Saf ürün, filtrasyon işlemi uygulanarak %50 oranında gliserol içeren saklama tamponuna alınmıştır. GroEL/GroES şaperonin sistemi, 2-100 kDa moleküler ağırlığa sahip katlı olmayan proteinlerin in-vitro ve in-vivoda katlanabilmesini sağlayan bir sistemdir. Farklı boyutlardaki proteinlerin katlanmasını %70 oranına kadar artırabildiği görülmüştür. Protein üretimi için yüksek verim sağlayabileceği düşünüldüğünden yüksek duyarlı DNA polimeraz'ın üretiminde bu sistem kullanılmıştır. Fakat bu sistem hedef proteinin miktarını artırırken, safsızlıkların da miktarını artırabilmektedir. Bu nedenle yüksek miktarda üretimi gerçekleştirilen enzimin saflaştırma aşaması oldukça gayret gerektirdi. Lac operonu tarafından yönetilen, hedef enzimi kodlayan genin ifadesi için IPTG kullanılarak sistem indüklenmiş, hücrelerin büyüme sıcaklığı 18°C'ye düşürülerek inklüzyon cisimciklerinin stabiliteleri bozulmuştur. Hücrenin metabolizma hızının ve dolayısıyla büyüme hızının yavaşladığı 12-20°C aralığındaki sıcaklık seçildiğinden, şaperonlar tarafından katlanmış protein miktarının artması sağlanmıştır. Hedef proteinle birlikte ortamda miktar olarak artış gösteren safsızlıkların büyük çoğunluğu, proteinlerin sıcaklık ile muamelesiyle elimine edilmiştir. Sıcaklığa dayanıklı olmayan hücresel proteinler ortamdan ayrılabilirken, sıcaklığa dayanıklı olduğu bilinen yüksek duyarlı DNA polimeraz enzimi, GroEL ve GroES proteinleri hala ortamdadır. GroEL ve GroES'nin ortamdan ayrılabilmesi adına IMAC afinite kromatografisi uygulanarak enzimin saflığı artırılmıştır. Saflaştırma sonuçları SDS-PAGE ve immünoblotlama ile analiz edilmiştir. Üç biyolojik tekrarlı 500 ml'lik bakteriyel üretim ve buradan elde edilen proteinlerin saflaştırılması sonucunda ~%90 saflığa sahip toplamda 60 000 PZR reaksiyonu için kullanılabilecek yeterlilikte, ticari muadilleri ile benzer kalitede yüksek duyarlı DNA Polimeraz enzimi üretilmiştir. Proteinin kalite testleri SDS-PAGE, immünoblotlama, peptit haritalama, Dairesel Dikroizm (CD); fonksiyon testleri PZR ile; kalite kontrol testleri dondur-çöz stres deneyleri, oda sıcaklığında stabilite deneyleri, sıcaklığa bağlı erime deneyleri gibi testler ile tamamlanmıştır. Üretilen proteinin hedef protein olduğunun kanıtlanması amacıyla Sıvı Kromatografisi-Kütle Spekrometresi (LC-MS) cihazı kullanılarak peptit haritalama yapılmıştır. Bu analiz için üç biyolojik tekrarlı üretim ve saflaştırması gerçekleştirilen enzimler jele yüklenerek SDS-PAGE yapılmıştır. Jelde yürütülen peptitler çeşitli yıkama aşamalarının ardından tripsin ile kesilerek jelden alınmıştır. Analizlere göre saflaştırılan proteinlerin, hedef yüksek duyarlı DNA polimeraz enzimi olduğu sonucuna varılmıştır. Üst akım ve alt akım çalışmaları sonucunda elde edilen proteinin fonksiyonel olup olmadığının belirlenmesi amacıyla Dairesel Dikroizm (CD) kullanılarak %90 üzerinde saflığa sahip proteinin ikincil yapı analizi far-UV (
Özet (Çeviri)
DNA polymerases found in all living cells discovered to date are the enzymes that synthesizes a new DNA strand complementary to template single stranded DNA. These enzymes do not only play a major role in the transmission of genetic information across generations during cell division, they also form the basis of Polymerase Chain Reaction (PCR), which is one of the most important in-vitro diagnostic techniques today. In addition to synthesis ability, DNA Polymerases may also have other properties including processivity, which is known as the ability of continuous polymerization, fidelity, which is known as the synthesis accuracy, and nucleotide selectivity. Thermostable DNA polymerase enzymes are mostly preferred in PCR-based studies because it is high importance that the stability of the enzymes used do not decrease depending on temperature. Taq DNA polymerase is the first discovered polymerase, which is a well-known enzyme used in a wide range of applications. Following the discovery of Taq DNA polymerase, the high-fidelity DNA polymerase was discovered in 1991 as a highly thermophilic DNA polymerase. Due to its high thermostability and proofreading properties, high-fidelity DNA polymerase is widely used in the applications that require high accuracy such as molecular cloning. High-fidelity DNA polymerase is an enzyme with a length of 775 amino acids and a molecular weight of about 90 kDa. This enzyme can perform 3'-5' exonuclease (proofreading) activity, which allows the addition of the correct nucleotides by removing the wrong nucleotides added to the structure during DNA synthesis. Due to this feature, it reduces the error rate during synthesis (1.3×10-6 mutations/base pairs/duplications), resulting in about 8 times less errors compared to Taq DNA polymerase. Many researchers have produced this protein by cloning it from Pyrococcus furiosus, a hyperthemophilic archaea, into different strains of Escherichia coli. The purification step is simplified by adding an affinity tag to the N- or C-terminus during the cloning. Based on these tags and various biophysical properties of the protein, purification protocols were created by affinity chromatography or ion exchange chromatography. In this study, we aimed to purify and characterize the high-fidelity DNA polymerase enzyme by taking the advantage of its thermal stability and 10X Polyhistidine-tag after bacterial production with high efficiency and low cost. For this purpose, commercially purchased pET16B. High-fidelity polymerase's plasmid DNA with a 10X Polyhistidine-tag at the N-terminus was used. The plasmid pET16B. High-fidelity polymerase was transformed into competent E. coli BL21(DE3) cells containing GroEL/GroES chaperonins to ensure soluble expression of the protein. In the first step of purification of High-fidelity DNA polymerase, which is a thermostable protein, all the folded proteins obtained from bacterial cells were heated and centrifuged to separate impurities with less thermal stability. High-fidelity DNA polymerase in soluble form was purified using IMAC affinity chromatography. The pure product was taken into a storage buffer containing 50% glycerol by filtration. The GroEL/GroES chaperonin system is a system that enables unfolded proteins with a molecular weight of 2-100 kDa to be folded in vitro and in vivo. Given that GroEL/GroES system can increase the folding of co-expressed recombinant proteins of different sizes by up to 70%, this system was employed in the production of High-fidelity DNA polymerase. However, while this system increases the amount of target protein, it can also increase the amount of impurities. Therefore, the purification of High-fidelity DNA polymerase was highly challenging. So that, various buffer compositions were used in order to optimize one step IMAC purification. Co-expression system was induced using IPTG for expression of pET16B. Expression of the polymerase regulated by the Lac operon. Since the growth temperature was chosen in the range of 12-20°C, where the metabolic rate of the cell and thus the growth rate was selected, the amount of protein folded by the chaperones was increased. Most of the impurities that increased with the target protein were eliminated with the 90°C heat treatment step. While heat sensitive proteins are eliminated from the environment, thermostable high-fidelity DNA polymerase enzyme, GroEL, and GroES proteins are still present. The separation of GroEL and GroES was achieved by applying IMAC affinity chromatography to increase the purity of the high-fidelity DNA polymerase enzyme. Purification results were analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting methods. At the end of 500 ml bacterial production and purification process with three biological repetitions, high-fidelity DNA polymerase enzyme of similar quality with its commercial counterparts was produced, which can be used for a total of 60 000 PCR reactions with ~90% purity. The protein band on the SDS-PAGE gel was excised and analysed by peptide mapping using Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS) system to confirm that the produced protein is the target protein. According to the analysis, it was concluded that the purified protein was the target DNA polymerase. In order to determine if the purified protein is correctly folded or not, the secondary structure analysis of the protein with a purity over 90% was performed using Circular Dichroism (CD) in the far-UV (
Benzer Tezler
- Recombinant expression, purification and characterization of TNFR1
TNFR1'in rekombinant üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
YAĞMUR ÖZ
Yüksek Lisans
İngilizce
2020
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Tetrahymena thermophila'da afinitik takılı insan büyüme hormonu'nun tetrahymena yapay koromozom vektör altyapısı ile rekombinant üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Recombinant production, purification and characterization of affinity-tagged human growth hormone with tetrahymena artificial chromosome vector system in tetrahymena thermophila
MEHMET ÇALISEKİ
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
BiyolojiEskişehir Teknik Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MUHİTTİN ARSLANYOLU
- Lon proteaz geninin çoklu kopyalarının streptomyces coelıcolor A3(2)'de homolog ifadesi ve Esherichia coli 'de heterolog ifadesi üzerine çalışmalar
Studies on expression of multiple copies of lon protease gene homologously in streptomyces coelicolor A3(2) and heterologously in Esherichia coli
HALİL YILMAZ
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
BiyolojiGebze Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SEDEF TUNCA GEDİK
DR. ÖĞR. ÜYESİ TUĞRUL DORUK
- Nokta mutasyonu yöntemi ile unag proteini varyantının (R112m/R132m) üretilmesi saflaştırılması ve karakterizasyonu
Expression, purification and characterization of unag protein variant (R112m / R132m) by site directed mutagenesis
RAMAZAN BAYAT
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
BiyokimyaKaramanoğlu Mehmetbey ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ YAKUP ULUSU
- Prolil endopeptidaz (PEP) enziminin Escherichia coli ekspresyon sisteminde çözünür formda eldesi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Obtaining, purification and characterization of soluble form of prolyl endopeptidaze (PEP) enzyme in Escherichia coli expression system
NEJLA BAKIR
Yüksek Lisans
Türkçe
2020
BiyomühendislikTokat Gaziosmanpaşa ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. İSA GÖKÇE