Geri Dön

Effects of extracellular vesicles derived from SOEC on in vitro development and quality of sheep embryos

Ovidukt epitelyal hücre kültüründen elde edilen ekstraselüler veziküllerin koyun embriyoların gelişimi ve kalitesi üzerine etkileri

PDF İndir

  1. Tez No: 769511
  2. Yazar: ISRAA FARIS MOHAMED FARIS
  3. Danışmanlar: PROF. DR. SEMA BİRLER
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Veteriner Hekimliği, Veterinary Medicine
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2022
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Dölerme ve Suni Tohumlama Ana Bilim Dalı​
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 67

Özet

Ovidukt; gamet olgunlaşması, taşınması ve spermatozoanın oositlere doğru yönlendirilmesi için uygun mikro ortamı sağlayan, başarılı bir fertilizasyon ve erken embriyo gelişimi için elzem olan bir organdır. Embriyo ve annenin reprodüktif kanalı arasındaki etkileşim (EV'ler gibi sinyallerin etkileşimi), başarılı embriyonik gelişim için çok önemlidir. Ovidukt, erken embriyonun maruz kaldığı ilk ortamdır ve bu yüzden embriyo ile anne arasındaki sinyallerin başlangıç noktası olduğu düşünülmektedir. Oviduktal epitel hücrelerinden türetilen EV'lerin (oEV'ler) rolünün ne olduğu henüz tam olarak anlaşılmamıştır. Bu konuda son yıllarda gerçekleştirilen çalışmalarla EV'lerin reprodüktif sistemde oynadıkları roller anlaşılmaya çalışılmaktadır. Oviduktal EV'lerle ilgili gerçekleştirilen en son çalışmalarda, EV'leri izole etmek için yoğunluk gradyanı, ultrasantrifüj/seri santrifüj, polimer bazlı presipitasyon ve ticari kitlerle immünoafinite gibi çeşitli yaklaşımlar kullanılmıştır. Mevcut literatüre bakıldığında, oviduktal EV'lere odaklanan çalışmaların sayısı, uterus EV'leri ve foliküler sıvı EV'leri gibi dişi reprodüktif organlarından türetilen diğer EV'lerle karşılaştırıldığında daha azdır. Çoğu çalışmada, ultrasantrifüj tekniği, oEV'leri izole etmek için tercih edilen bir teknik olmuştur. Çünkü bu çalışmaların çoğunda oEV'lerin gamet\embriyolar üzerindeki fonksiyonel etkilerini araştırmak amaçlanmıştır. Sunulan çalışmada, yardımlı üreme tekniklerinde gebelik oranlarını iyileştirme konusunda esas olan in vitro embriyo üretimi üzerine ovidukt epiteli kaynaklı EV'lerin etkilerine odaklanılmıştır. Mevcut hipotezin amaçları, ilk olarak, koyun ovidukt epitel hücrelerinden (SOEC) koşullandırılmış (conditioned)-medyum toplamak için tek katmanlı SOEC hücre kültürünü elde etmekti. Daha sonra, ekstraselüler veziküller (EV), koşullandırılmış ortamdan sıralı ultrasantrifüj ile izole edildi ve nano-tracking analizi ile karakterize edilerek konsantrasyonu saptandı. SOEC-koşullandırılmış ortamdan oEV'lerin izolasyonundan sonra, SOEC'den türetilen EV'ler embriyo in vitro kültür ortamına eklenerek, EV'lerin embriyo gelişimi ve kalitesi üzerindeki etkileri araştırıldı. Ovidukt epitel hücre kültürü, oEV'lerinin rolünü incelemek için temel bir işlemdir. Bu çalışmada, koyun ovidukt epitel hücrelerinin izolasyonunu gerçekleştirmek için iki yöntem kullanılmıştır. Üzerinde dominant folikül ve korpus luteum bulunmayan yumurtalıklar, uzunlamasına açıldı. Ovidukt iç yüzeyindeki hücreler steril bir lam kullanılarak (bir kez) kazındı, içinde doku kültürü medyumu bulunan bir tüp içerisine toplandı ve sonra ekildi. Kullanılan diğer yöntem ise yıkama tekniğiydi. Bu teknikte öncelikle ovidukt boylamasına steril bir petri kutusunun içerisine sıkıldıktan sonra, ovidukt lümeni aynı petri kabı içerisine %10 FCS ilaveli 1 mL DMEM medyumu ile yıkandı. Sağlıklı ve açık renkli hücre kümeleri toplandı ve kültür medyumu (%10 FCS ilaveli DMEM) bulunan bir petri içerisine ekildi. Kültür medyumu, hücreler %90 konfluensiye ulaşana kadar her 48 saatte bir değiştirildi. Hücrelerin yayılması %90 civarına ulaştığında, medyum atıldı, yerine %10 oranında EV-depleted (EV'lerden arındırımış) FCS ilave edilmiş DMEM eklendi ve hücreler 24 saat bu ortamda inkübe edildi. İnkübasyondan sonra, SOEC-EV'leri izole etmek için koşullandırılmış-medyum toplandı. Sıyırma yöntemi ile elde edilen 27 mL ve yıkama yöntemi ile elde edilen 10 mL olan koşullandırılmış-medyuma sıralı ultrasantrifüj tekniği uygulandı. Bu yöntemde öncelikle, kalıntıları ve ölü hücreleri uzaklaştırmak için 300 g'de 10 dakika santrifüj yapıldı. Süpernatan alındı ve apoptotik cisimlerin uzaklaştırılması için 2000 g'de 20 dakika santrifüje edildi. Tekrar süpernatan alınarak büyük veziküllerin atılması için 10.000 g'de 30 dakika ve 20.000 g'de 40 dakika santrifüjlendi. Son olarak, süpernatan 100.000 g'de 60 dakika santrifüje edildi. Son santrifüjden sonra süpernatan tamamen atıldı ve santrifüj tüpleri EV'leri çözmek için 1 mL fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkandı. Elde edilen EV'nin boyutlarını ve konsantrasyonunu belirlemek için Nano İzleme Analizi (NTA) gerçekleştirildi. Yıkama yöntemiyle elde edilen SOEC-EV'lerin konsantrasyonu ve tek bir EV'nin ortalama boyutu sırasıyla 3.46x109 partikül/mL ve 200 nm olarak değerlendirildi. Kazıma yöntemiyle elde edilen SOEC-EV'lerin konsantrasyonu ve ortalama boyutu sırasıyla 9.80x109 partikül/mL ve 184 nm olarak değerlendirildi. SOEC'den türetilen EV'lerin embriyo gelişimi ve kalitesi üzerindeki etkilerinin incelenmesi amacıyla, izole EV'ler in vitro embriyo kültür ortamına eklendi ve embriyoların yarıklanma ve blastosist oranları, ayrıca embriyo kalitesi değerlendirildi. Embriyo kültür medyumu (SOFaa) içerisine, düşük EV (9.8x106 EV/50µL), orta EV (49x106 EV/50µL) ve yüksek EV (98x106 EV/50µL) konsantrasyonlarında SOEC'den türetilen EV'ler katıldı ve hiç EV katılmayan kontrol grubu ile karşılaştırıldı. Yarıklanma (2. Gün) ve blastosist gelişimi (8. Gün) değerlendirildi. Tüm grupların (Kontrol, Düşük EV, Orta EV ve Yüksek EV) yarıklanma ve blastosist oranları sırasıyla %68.40, %64.66, %66.00, %59.53; ve %23.39, %33.54, %29.09 ve %26.80'dir. Gruplar arasında dikkate değer farklılıklar olmasına rağmen, istatistiksel olarak sonuçlar arasındaki farklar anlamlı olmadı (p>0.05). Kontrol, Düşük EV, Orta EV ve Yüksek EV gruplarındaki blastosistlerde toplam hücre sayısı (±SEM) sırasıyla 142.75±11.93, 298.25±36.11, 225.33±15.38 ve 279.38±15.32 olarak saptandı. EV eklenen gruplarda blastosistlerin daha kaliteli oldukları saptandı (p

Özet (Çeviri)

The oviduct provides an appropriate micro-environment for gamete maturation and transport, and the direction of spermatozoa toward the oocytes conducting successful fertilization and sustaining early embryo development. The interaction of signals such as EVs between the embryo and the mother environment is crucial to successful embryo development. The oviduct is the first environment in which the zygote is exposed and is assumed to be the starting point of signals between the embryo and the mother. The role of oviductal epithelial cells-derived EVs (oEVs) needs to be more adequately understood; several experiments have attempted to achieve further knowledge. In most recent studies of oEVs, various approaches were used to isolate the EVs such as polymer-based precipitation, density gradient, ultracentrifugation\serial centrifugations, and immunoaffinity. Regarding the existing publications, studies focused on the oEVs is few compared with other EVs (uterine and follicular fluid EVs). Ultracentrifugation was the preferred technique to isolate the oEVs because most aimed to investigate the effects of oEVs on gametes and/or embryos. This study focused on oviductal epithelial-derived-EVs' effects on in vitro embryo production, which can be essential in improving pregnancy rates in mammals ART. The aims of the current hypothesis were, firstly, to obtain a monolayer cell culture of sheep oviductal epithelial cells (SOEC) to collect conditioned media. Then, extracellular vesicles were isolated from the conditioned oviductal cell culture media by sequential ultracentrifugation, quantified, and characterized by the nano-tracking analysis. After the isolation of oEVs from SOEC-conditioned media, the SOEC-derived-EVs were supplemented into the embryo culture medium and investigated their effects on the development of embryos and quality. Oviductal epithelial cell culture is a fundamental step for studying the role of the oviducts oEVs. In this study two methods were used to perform the isolation of sheep oviductal epithelial cells for culturing. Ovaries that demonstrated follicle growth and absence of the corpus luteum were picked as the follicular phase oviducts were cut longitudinally. Cells were scraped by a glass slide and seeded. The other method was the flushing technique. After squeezing the oviduct longitudinally, the oviductal lumen was flushed with 1 mL of DMEM supplemented with FCS (10%) in a petri dish. Healthy and light-colored clumps of cells were collected and seeded. The medium was substituted every 48 hours until the cells reached 90% confluency. Therefore, the medium was discarded, replaced by DMEM supplemented with EV-depleted FCS (10%), and incubated for 24 hours. After the incubation, the conditioned media were collected. Ultracentrifugation technique was applied to conditioned media which were 27 mL of scraping method and 10 mL of flushing method in order to isolate the SOEC-EVs. Centrifugation was started at 300 g for 10 minutes to remove the debris and dead cells. The supernatant was centrifuged at 2000 g for 20 minutes to pellet apoptotic bodies. The volume was centrifuged at 10.000 g for 30 minutes and 20.000 g for 40 minutes to remove the large vesicles; the last centrifuge was achieved at 100.000 g for 60 minutes. After the last centrifugation, the supernatant discarded, and the tubes were washed with 1 mL PBS to dissolve the EVs. Nano Tracking Analysis (NTA) was used to characterize and quantify the size of a single EV and the concentration. The SOEC-EVs concentration and mean size of a single EV obtained by the flushing method were assessed as 3.46x109 particles/mL and 200 nm, respectively. The SOEC-EVs concentration and mean size of a single EV obtained by scraping method were assessed as 9.80x109 particles/mL and 184 nm respectively. The examination of SOEC-derived EVs' effects on the development of embryos and quality was performed by supplementing the isolated EVs into embryo culture media. Presumptive zygotes were cultured in SOFaa supplemented with SOEC-derived EVs in different concentrations of low EV (9.8x106 EVs/50µL), medium EV (49x106 EVs/50µL), and high EV (98x106 EVs/50µL). The cleavage rates and the blastocyst development were evaluated at Day 2 and Day 8, respectively. Cleavage and blastocyst rates of all groups (Control, Low EV, Medium EV, and High EV) were 68.40%, 64.66%, 66.00%, 59.53%; and 23.39%, 33.54%, 29.09% and 26.80%, respectively. Although there were remarkable differences between groups, yet were not important statistically (p>0.05). The total cell number of embryos (±SEM) in Control, Low EV, Medium EV and High EV groups were counted at Day 8 blastocysts as 142.75±11.93, 298.25±36.11, 225.33±15.38 and 279.38±15.32, respectively. The qualities of blastocysts were more reasonable in EV-added groups than in the control (p

Benzer Tezler

  1. Tez No

    904836

    Scavenger roles of mammalian and plant-derived extracellular vesicles against cisplatin ototoxicity

    Memeli ve bitkisel kökenli hücre dışı veziküllerin sisplatin ototoksisitesine karşı detoksifikasyon rolleri

    DERYA SAĞRAÇ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    BiyoteknolojiYeditepe Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. FİKRETTİN ŞAHİN

  2. Tez No

    340987

    Immunomodulatory effects of commensal bacteria-derived membrane vesicles

    Kommensal bakteri kökenli membran keseciklerinin immünomodülator etkileri

    ESİN ALPDÜNDAR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    Allerji ve İmmünolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MAYDA GÜRSEL

  3. Tez No

    863547

    Nijer tohumundan elde edilen eksozom benzeri nanopartiküllerin insan nöroblastoma hücre hattındaki olası terapotik etkilerinin araştırılması

    Investigation of the potential therapeutic effects of exosome-like nanoparticles derived from niger seed on human neuroblastoma cell lines

    KÜBRA BAŞTUĞ ÖZTOPUZ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    BiyofizikGazi Üniversitesi

    Biyofizik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MERİÇ ARDA EŞMEKAYA

  4. Tez No

    346162

    In vitro and in vivo immunomodulatory effects of extracellular vesicles

    Hücre dışı keseciklerin in vitro ve in vivo immünmodülatör etkileri

    MEHMET ŞAHİN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    Biyolojiİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. İHSAN GÜRSEL

  5. Tez No

    520303

    Immunomodulatory effects of exosomes: Promising candidates in immunotherapy

    Eksozomların immünomodülator etkileri: İmmün tedavide umut verici adaylar

    HAVVA ÖZGEN KILGÖZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    Biyolojiİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Bilim Dalı

    PROF. DR. İHSAN GÜRSEL

Geri Dön