Geri Dön

Pichia pastoris'te rekombinant kimozin üretiminin araştırılması

Investigation of recombinant chymosin production in Pichia pastoris

PDF İndir

  1. Tez No: 771602
  2. Yazar: FATMA ERSÖZ
  3. Danışmanlar: PROF. DR. MEHMET İNAN
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoteknoloji, Gıda Mühendisliği, Biotechnology, Food Engineering
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2022
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Akdeniz Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Gıda Mühendisliği Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 133

Özet

Bu tez çalışması, peynir endüstrisinde sütün pıhtılaştırılması amacıyla kullanılan kimozin enzimini yüksek verimlilikte üreten bir maya klonunun geliştirilmesi ve bazı temel üretim parametrelerinin belirlenmesi amacıyla yapılmıştır. Çalışma kapsamında sığır gen kaynaklı kimozin enziminin Pichia pastoris'te farklı promotorlar kontrolünde, farklı konak hücrelerde rekombinant olarak üretimi gerçekleştirilmiştir. Üretim miktarının arttırılabilmesi amacıyla diploid hücre formlarında, yüksek gen kopyası içeren haploid klonlarda ve şaperon protein overekspresyonu ile enzim üretimi gibi yöntemler denenmiştir. Bu amaçla çalışmanın ilk bölümünde yabanıl tip P. pastoris X33 hücrelerinde yapısal GAP promotoru altında enzim üretimi gerçekleştirilmiştir. Kimozin genini 1 kopya içeren haploid formdaki klon ile erlenmayer ölçeğinde 5.3 IMCU/mL, fermentör ölçeğinde ise 18 IMCU/mL değerlerinde enzim aktivitesi elde edilmiştir. Ancak bu klon ile enzim üretim seviyesi yetersiz kaldığı için verimi arttırabilmek amacıyla diploid formdaki hücreler ile enzim üretimi denenmiştir. Bu amaçla kimozin genini 1 kopya içeren okzotrof GS115(his4) ve JC220(ade1) konakçılarının eşleşme ile diploid formu oluşturulmuş ve bu formunda erlenmayer ölçekli üretimde 3 IMCU/mL enzim aktivitesi tespit edilmiş, fermentör üretimi denenmemiştir. Diploid formdaki bu hücrede haploid X33 hücrelerine göre daha düşük seviyede enzim üretimi görülmüştür. Sanayi boyutlu üretimlerde besleme prosesi açısından (ucuz besin kaynağı olan glukoz ile besleme) kolaylık sağlaması amacıyla çalışmanın bu kısmında yapısal GAP promotoru tercih edilmiş ancak düşük verimlilikten dolayı çalışmanın devamında promotor değişikliği yapılmıştır. Çalışmanın ikinci bölümünde yapısal GAP promotoruna göre daha güçlü olduğu bilinen, etanol ile indüklenen sentetik ADH2SNT5 promotoru kullanılmış, P. pastoris KM71 hücrelerinde enzim üretimi yapılmıştır. Erlenmayer ölçeğinde gerçekleştirilen üretimler sonucu 18 IMCU/mL civarında enzim aktivitesi elde edilmiş, fermentör ölçeğinde ise bu değer 45 IMCU/mL seviyesine ulaşmıştır. Ancak elde edilen bu değerin arttırılabilmesi amacıyla çalışmanın bir sonraki bölümünde kimozin genini yüksek kopya sayıda içeren çoklu kopyalı kimozin klonları oluşturulmuştur. Çoklu kopyalı kimozin klonlarının elde edilmesi amacıyla çalışmanın üçüncü bölümünde in vitro koşullarda sentetik ADH2SNT5 promotoru kontrolünde 4 kopyaya kadar sığır kimozini içeren P. pastoris KM71 klonları oluşturulmuştur. Oluşturulan bu klonlarda erlenmayer ölçeğinde gerçekleşen üretimlerde en yüksek enzim aktivitesi 6.3 IMCU/mL değeri ile 2 kopya kimozin geni içeren klonda tespit edilmiştir. Beklenenin aksine kimozin genini 2 kopya içeren klonda 1 kopyaya göre artış gözlemlenmişken daha yüksek kopyalarda ise azalma görülmüştür. Oluşturulan klonlarda kimozin gen kopya sayısının artması ile üretilen enzim miktarı artsa da enzimin hücre dışına sekresyonunun tam olarak sağlanamadığı düşünülmektedir. Bu amaçla çalışmanın dördüncü bölümünde enzim üretim miktarının arttırılabilmesi amacıyla yüksek kopyalı kimozin klonlarında, PDI şaperon proteininin ekstra 2 gen kopya sayısına kadar overekspresyonu sağlanmış ve protein üretim miktarlarına etkisi incelenmiştir. PDI overekspresyonu ile oluşturulan klonlar arasında erlenmayer ölçeğinde gerçekleştirilen üretimlerde en yüksek enzim aktivitesinin 8.2 IMCU/mL değeri ile 2 kopya kimozin ve 2 kopya PDI içeren klonda tespit edildiği görülmüştür. Bu klonlar ile fermentör ölçekli gerçekleştirilen üretimlerde ise elde edilen enzim aktivite değerleri 2 kopya kimozin içeren klonda 20 IMCU/mL seviyesinde iken 2 kopya kimozin+2 kopya PDI geni içeren klonda 39 IMCU/mL seviyesine ulaşmıştır. PDI overekspresyonu ile aynı klonun enzim aktivite değeri yaklaşık 2 kat arttırılmış olmasına rağmen hedeflenen üretim yakalanamamıştır. Çalışma kapsamında oluşturulan tüm klonlar arasında fermentör ölçeğinde 28°C ve pH 3 şartlarında gerçekleştirilen üretimlerde en yüksek enzim aktivitesi, 45 IMCU/mL değeri ile ikinci bölümde oluşturulan pADH2SNT5HIS4-BtCHY-C#12 (KM71) klonunda tespit edilmiştir. Bu klonda enzim aktivite değerinin arttırılması amacıyla farklı sıcaklık ve pH değerlerinde üretimler yapılmıştır. Denenen farklı sıcaklık ve pH'lar arasında en yüksek enzim aktivitesinin 75 IMCU/mL ile 24°C ve pH 4'te elde edildiği görülmüştür. Bu sebeple en yüksek enzim aktivitesini gösteren bu aday klon ile sanayi boyutlu üretim için fermentör ölçeğinde sıcaklık ve pH gibi bazı parametreleri belirlenmiş olan bir üretim prosesi geliştirilmiştir.

Özet (Çeviri)

This thesis study was carried out to develop a yeast clone that produced the chymosin enzyme, which is used for milk coagulation in the cheese industry, with high efficiency and to determine some basic production parameters. In this study, bovine chymosin was produced in Pichia pastoris by recombinantly by using different host cells and promotors. To increase the production amount, methods such as diploid cell forms, haploid clones with high gene copies and chaperon protein overexpression have been tried. In the first part of the study, enzyme production was carried out under the structural GAP promoter in wild type P. pastoris X33 cells. With the clone containing 1 copy of the chymosin gene, enzyme activity was obtained at 5.3 IMCU/mL in the shake flask scale and 18 IMCU/mL in the bioreactor scale. However, the enzyme production level was insufficient with this clone, so enzyme production was tried with cells in diploid form to increase the yield. For this purpose, diploid cells were formed by mating of auxotroph GS115(his4) and JC220(ade1) hosts containing 1 copy of the chymosin gene, and in this form, 3 IMCU/mL enzyme activity was detected in shake flask scale production, and bioreactor production was not tested. In this part, the structural GAP promoter was preferred, but due to low efficiency, the promoter was changed the next part of this study. In the second part of the study, ethanol induced synthetic ADH2SNT5 promoter, which is known to be stronger than the structural GAP promoter, was used, and enzyme production was performed in P. pastoris KM71 cells. As a result of the productions carried out on the shake flask, the enzyme activity was around 18 IMCU/mL, and this value reached the level of 45 IMCU/mL at the bioreactor scale. To increase this value, in the next part of the study, multicopy chymosin clones were created. In order to obtain multicopy chymosin clones, up to 4 copies of bovine chymosin gene under the control of synthetic ADH2SNT5 promoter in P. pastoris KM71 cells were created in vitro conditions in the third part of this study. The highest enzyme activity was detected in the clone containing 2 copies of chymosin gene with an IMCU/mL value of 6.3 in shake flask scale production. Contrary to expectations, an increase was observed in the clone containing 2 copies of the chymosin gene compared to 1 copy containing clone, while a decrease was observed in higher copies. Although the amount of enzyme produced increases with the high copy chymosin clones, it is thought that the extracellular secretion of the enzyme is not fully achieved. For this purpose, in the fourth part of the study, to increase the amount of enzyme production, PDI chaperone protein was overexpressed up to 2 extra gene copy numbers in high copy chymosin clones and its effect on protein production amounts was investigated. It was observed that the highest enzyme activity was detected in the clone containing 2 copies of chymosin and 2 copies of PDI with an IMCU/mL value of 8.2 in shake flask scale production. In the bioreactor scale productions, the enzyme activity values obtained were 20 IMCU/mL (for 2 copy chymosin clone) and 39 IMCU/mL (for 2 copy chymosin+2 copy extra PDI gene containing clone), respectively. Although the enzyme activity value of the same clone was increased approximately 2-fold with PDI overexpression, the targeted production could not be achieved. Among the all clones, the highest enzyme activity was detected in the pADH2SNT5HIS4-BtCHY-C#12 (KM71) clone, which was created in the second section with 45 IMCU/mL value in the fermentor scale productions at 28°C and pH 3 conditions. To increase the enzyme activity, different pH and temperatures were tested at bioreactor scale production. It was observed that the highest enzyme activity (75 IMCU/mL) was obtained at 24°C and pH 4 among the different temperatures and pHs tested. For this reason, with this candidate clone, a production process has been developed for industrial-scale production, in which some parameters such as temperature and pH are determined at the bioreactor scale.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    438039

    Rekombinant kimozin üretiminde glikozilasyonun etkisinin araştırılması

    The effect of glycosylation on recombinant chymosin production

    FATMA ERSÖZ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2016

    BiyoteknolojiAkdeniz Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET İNAN

  2. Tez No

    543931

    Oryctolagus cuniculus kimozin geninin Pichia pastoris'te ekspresyonunun optimizasyonu

    Optimization of Oryctolagus cuniculus chymosin gene expression in Pichia pastoris

    SELİN ALİHANOĞLU

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    Gıda MühendisliğiHarran Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MEHMET KARAASLAN

  3. Tez No

    621946

    Pichia pastoris'te rekombinant bakteriyel alfa amilaz üretimi

    Production of recombinant bacterial alpha amylase in Pichia pastoris

    ŞEYDA GÜLLÜ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2020

    Gıda MühendisliğiAkdeniz Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET İNAN

  4. Tez No

    807233

    Pichia pastoris'te rekombinant insan dornaz alfa üretimi

    Production of recombinant human dornase alfa in Pichia pastoris

    AYÇA URAS

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    BiyomühendislikAkdeniz Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET İNAN

  5. Tez No

    608356

    Determination of optimal bioreactor operational strategy and unstructured macrokinetic model for recombinant human growth hormone production on ethanol by a novel Pichia pastoris pADH2-cAT8-L2 based system

    Pichia pastoris ile pADH2-cAT8-L2 promotor altında rekombinant insan büyüme hormonu üretimi için etanol-temelli biyoreaktör işletim stratejisi geliştirilmesi ve modellenmesi

    OMAR WEHBE AL MASRI WEHBE AL MASRI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    BiyomühendislikOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

Geri Dön