Geri Dön

Pichia pastoris'te rekombinant laktaz enzimi üretimi

Recombinant lactase enzyme production in pichia pastoris

PDF İndir

  1. Tez No: 955167
  2. Yazar: NESLİHAN CEYLAN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. MEHMET İNAN
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Gıda Mühendisliği, Biotechnology, Food Engineering
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Akdeniz Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 90

Özet

Laktaz enzimi süt şekeri olarak bilinen laktozu katabolik reaksiyonlar ile parçalayarak glikoz ve galaktoz alt monomerlerine dönüştüren bir enzimdir. Diğer adıyla β-galaktosidaz olarak da bilinen laktaz enzimi özellikle gıda sanayisinde laktozsuz süt ve süt ürünleri üretmek amacıyla kullanılmaktadır. Toplumun geniş bir kesiminde bulunan laktoz intoleransı, laktozsuz ürünlere olan talebi artırmaktadır. Dünya nüfusunun yaklaşık %70' ini etkileyen bu hassasiyet, bebeklik döneminden başlayarak yetişkin insanlarda şişkinlik, bağırsak ağrısı, kusma ve ishal gibi gastrointestinal sorunlara neden olmaktadır. Hassasiyeti bulunan kişilerde yaşam konforunu önemli ölçüde etkilediği için günlük diyette gıda takviyesi olarak kullanımı mevcuttur. Günümüzde laktaz enzimi (β- galaktosidaz), endüstriyel ölçekte ağırlıklı olarak mikrobiyal fermantasyon ve rekombinant DNA teknikleri kullanılarak üretilmektedir. Bu üretim yöntemleri, yüksek verim, düşük maliyet ve sürdürülebilirlik gibi avantajlar sunmakta olup, literatür bilgisi veremezsin burada bu çalışma kapsamında enzimin Pichia pastoris (P. pastoris) mayasında etanol ile indüklenebilen mutant ADH2 promotoru kontrolünde rekombinant üretimi yapılmıştır. Çalışma kapsamında, sentetik kodon optimize olarak temin edilen Aspergillus oryzae (A. oryzae) laktaz geni sentetik SNT5 promotoru altına klonlanmış ve oluşturulan pSNT5α-Lac ekspresyon vektörünün P. pastoris MK115(PDI)suşuna transforme edilmiştir. Transformasyon sonrasında elde edilen P. pastoris MK115(PDI)#1 ve #2 klonları ile engelli erlenmayerde üretim ile sıcaklık (20-24-28℃) ve pH (3.0-7.0) optimizasyonu yapılmıştır. Laktaz enzim üretimi için optimum pH ve sıcaklık değeri pH 6 ve 28 ℃ olarak belirlenmiştir. Erlenmayer ölçekli üretimler sonucunda seçilen P. pastoris MK115(PDI) #1 klonu kullanılarak pH 6.0 ve 28℃ koşullarında hücre dışına sekresyon şeklinde yapılan üretimlerde en yüksek enzim aktivitesi 6,800,000 U/mL, en yüksek toplam protein miktarı 512 mg/L olarak tespit edilmiştir. Erlenmayer koşullarında belirlenen optimum sıcaklık ve pH değerlerinde, FM22 besiyeri kullanılarak biyoreaktör ölçeğinde enzim üretimi geçekleştirilmiştir. Yaklaşık 95 saat süren fermantasyon sonucunda süpernatant örneklerinde enzim aktivite değerleri ve toplam protein miktarı sırasıyla 18,400,000 U/mL ve 3177 mg/L şeklinde tespit edilmiştir. Çalışma sonucunda A. oryzae laktaz enziminin etanol ile indüklenebilen SNT5 promotoru altında P. pastoris MK115(PDI) suşunda üretimi yapılmış ve endüstriyel boyutta laktaz üretimi için biyoproses verileri elde edilmiştir

Özet (Çeviri)

Lactase enzyme is a biocatalyst that breaks down lactose, commonly known as milk sugar, through catabolic reactions into its submonomers glucose and galactose. Also known as β-galactosidase, the lactase enzyme is especially utilized in the food industry to produce lactose-free milk and dairy products. The widespread prevalence of lactose intolerance among the population has significantly increased the demand for lactose-free products. This sensitivity, which affects approximately 70% of the global population, can lead to gastrointestinal problems such as bloating, intestinal pain, vomiting, and diarrhea in adults, starting from infancy. Due to its considerable impact on quality of life, the enzyme is also used as a nutritional supplement in daily diets for sensitive individuals. Today, lactase (β-galactosidase) is predominantly produced on an industrial scale using microbial fermentation and recombinant DNA techniques. These production methods offer advantages such as high yield, low cost, and sustainability. In this study, the enzyme was recombinantly produced in Pichia pastoris (P. pastoris) yeast under the control of an ethanol-inducible mutant ADH2 promoter. As part of the study, a synthetic codon-optimized lactase gene from Aspergillus oryzae (A. oryzae) was cloned under a synthetic SNT5 promoter, and the resulting pSNT5α-Lac expression vector was transformed into a P. pastoris MK115 (PDI) strain. Following transformation, P. pastoris MK115 (PDI) #1 and #2 clones were used for production in baffled flasks, during which temperature (20–24–28°C) and pH (3.0–7.0) optimization studies were conducted. The optimum conditions for lactase enzyme production were determined to be pH 6 and 28°C. Using these parameters, shake-flask scale production with the selected P. pastoris MK115 (PDI) #1 clone led to extracellular secretion of the enzyme, achieving a maximum enzyme activity of 6,800,000 U/mL and a maximum total protein concentration of 512 mg/L. Subsequently, enzyme production was scaled up to a bioreactor under the same optimized temperature and pH conditions using FM22 medium. After approximately 95 hours of fermentation, the enzyme activity and total protein concentration in the supernatant samples were determined as 18,400,000 U/mL and 3177 mg/L, respectively. As a result of the study, A. oryzae lactase enzyme was successfully produced in the P. pastoris MK115 (PDI) strain under the control of the ethanol-inducible SNT5 promoter, and bioprocess data were obtained for industrial-scale lactase production.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    467327

    Pycnoporus sanguineus kaynaklı rekombinant lakkaz PSLCC2 kullanımı ile tekstil boyalarında renk giderimi

    Decolorization of textile dyes using recombinant laccase PSLCC2 from Pycnoporus sanguineus

    KORAY MALCI

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYTEN KARATAŞ

  2. Tez No

    450935

    Cloning of a cDNA encoding laccase from coriolopsis polyzona MUCL 38443 and expression in Pichia pastoris

    Coriolopsis polyzona MUCL 38443'ten lakkaz kodlayan bir cDNA'nın klonlanması ve Pichia pastoris'te ifade edilmesi

    ORKUN PİNAR

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYTEN KARATAŞ

  3. Tez No

    539046

    Recombinant production of pectinolytic enzymes in pichia pastoris and process optimization for food industry

    Gıda endüstrisinde kullanılan pektinaz enziminin pichia pastoris'te rekombinant üretimi ve süreç optimizasyonu

    GÜLŞAH AKÇADAĞ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    BiyomühendislikYeditepe Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ İLKEM EMRAH NİKEREL

  4. Tez No

    315382

    Cloning of The Laccase cDNAs from Pycnoporus sanguineus MUCL 38531, Expression in Pichia pastoris and Characterization of Recombinant Laccases

    Pycnoporus sanguineus?tan Lakkaz cDNA?larının Klonlanması, Pichia pastoris?te Ekspresyonu ve Rekombinant Lakkazların Karakterizasyonu

    GÜNSELİ KURT GÜR

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ

  5. Tez No

    255236

    Effects of carbon sources and feeding strategies on human growth hormone production by metabolically engineered Pichia pastoris

    Karbon kaynaklarının ve besleme stratejilerinin rekombinant Pichia pastoris ile insan büyüme hormonu üretimine etkisi

    EDA AÇIK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2009

    BiyomühendislikOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. TUNÇER ÖZDAMAR

Geri Dön