Termofilik Bacillus licheniformis SO5'den α-amilazın manyetik alan destekli üçlü faz ayırma sistemi ile saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of α-amylase from thermophilic Bacillus licheniformis SO5 using magnetic field-assisted three phase partitioning
- Tez No: 778573
- Danışmanlar: PROF. DR. MELDA ŞİŞECİOĞLU
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2023
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Atatürk Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 82
Özet
Amaç: Günümüzde nişasta hidrolizi mikrobiyal α-amilazlar kullanılarak gerçekleştirilmektedir. Amilazlar etanol, ekmek ve yüksek fruktozlu mısır şurubu üretimi, gıda, tekstil, kağıt ve deterjan endüstrileri gibi çok çeşitli endüstriyel uygulamalarda kullanılmaktadırlar. Yapılan tez çalışmasında; Bacillus licheniformis SO5 suşundan elde edilen amilazın hızlı, tek adımlı, basit ve yeni bir teknik olan manyetik alan destekli üçlü faz ayırma sistemi (MFTPP:Magnetic Field-assisted Three Phase Partitioning) ile kısmi saflaştırılması, karakterizasyon çalışmalarının yapılması ve gıda endüstrisinde kullanım potansiyelinin araştırılması hedeflenmiştir. Yöntem: Bacillus licheniformis SO5 (GenBank No: MG076975) suşundan α-amilaz üçlü faz ayırma (TPP) kullanılarak tek bir adımda kısmi olarak saflaştırıldı. Daha sonra bu sistemin faz ayrıştırma oranlarını artırmak (yöntemin süresini azaltmak) için kullanılan teknik, manyetik alan ile kombine edildi ve manyetik alanın ekstraksiyon geri kazanımı üzerindeki etkisi incelendi. Saflaştırılan amilazın biyokimyasal karakterizasyonu yapılarak enzim preparasyonunun ekmek yapım sürecindeki performansı araştırıldı. Bulgular: α-Amilaz enziminin TPP tekniğiyle saflaştırılması sırasında ilk olarak tuz, organik çözgen, pH, süre, sıcaklık optimizasyonu yapıldı. pH 9,0'da, 1,0:1,5 (kültür sıvısı:t-bütanol oranı), %30 amonyum sülfat doygunluğunda, 60 dakika boyunca 30oC'de gerçekleştirilen TPP sonucunda enzim %105 verimle 1,84 kat saflaştırıldı. Bu tez kapsamında literatürde ilk defa uygulanan MFTPP ile manyetik alan süresi, görev döngüsü ve manyetik alan gücü değiştirilerek yapılan bir dizi deney sonucunda sırasıyla 10 dk, %30 ve 70 W'da %195 verimle 3,07 kat saflaştırma gerçekleştirildi. Enzimin molekül ağırlığı SDS-PAGE ile ~68,7 kDa olarak hesaplandı. α-Amilaz enzimi için optimum pH 7,0 ve optimum sıcaklık 50oC olarak belirlendi. Enzimin 20-90oC sıcaklık aralığında bütün değerlerde 30 ve 60. dk'da aktiviteyi %40 üzerinde koruduğu tespit edildi. %1 ve %5'lik konsantrasyonlardaki yüzey aktif maddelerin varlığında enzimin yüksek oranda stabil kaldığı, %10 ve %30'luk konsantrasyonlarda kullanılan organik çözücülerin aktiviteyi artırdığı, Fe2, Mn2, Zn2 ve Mg2 metallerinin varlığında enzim aktivitesinin arttığı belirlendi. B. licheniformis SO5 enziminin buğday nişastası substratı için Km, Vmax, Kcat, ve Kcat/Km değerleri sırasıyla 1,19 μM, 3,42 μmol.mL-1.dk-1, 1,425 s-1 ve 1,2 s-1.mM-1 olarak hesaplandı. Ayrıca fırıncılık endüstrisinde kullanım potansiyelini araştırmak amacıyla saflaştırılan α-amilaz enzimi ile pişirme testleri gerçekleştirildi ve kullanılan enzimin mayalanma, ekmek şekli ve yumuşaklık açısından ekmek yapımı üzerinde katkı sağladığı tespit edildi. Sonuç: Günümüzde biyomolekülleri saflaştırmak için gelişmiş ayırma tekniklerine yönelik güçlü bir talep bulunmaktadır. Çünkü etkili bir saflaştırma prosesi, üretimin en önemli adımlarından birisidir ve toplam maliyetin önemli bir bölümünü oluşturmaktadır. Sonuç olarak bu tez kapsamında, manyetik alan destekli TPP'nin, α-amilazın yüksek verimle kısa sürede kısmen saflaştırılması için etkili ve yeni bir teknik olduğu bulundu. Ayrıca, B. licheniformis SO5 α-amilazının geniş bir sıcaklık ve pH aralığındaki aktivitesi ve kararlılığı, çeşitli metal iyonları, organik çözücüler ve yüzey aktif maddeleri varlığındaki nispeten yüksek kararlılığı ve ekmek yapımında kullanılabilme potansiyeli bu enzimin gıda başta olmak üzere pekçok endüstriyel uygulama için uygun bir aday olduğunu göstermektedir.
Özet (Çeviri)
Purpose: Today, starch hydrolysis is carried out using microbial α-amylases. Amylases are used in a variety of industrial applications, such as production of ethanol, bread and high fructose corn syrup production, as well as food, textile, paper and detergent industries. In the thesis study; It is aimed to partially purify the amylase obtained from Bacillus licheniformis SO5 by a fast, one-step, simple and new technical magnetic field assisted three phase separation system (MFTPP: Magnetic Field-assisted Three Phase Partitioning), perform characterization studies and investigate its potential for use in the food industry. Method: α-Amylase was partially purified from strain Bacillus licheniformis SO5 (GenBank No: MG076975) in a single step using triple phase separation (TPP). Then the technique was combined with the magnetic field to increase the phase separation rates of this system (reducing the time of the method) and the effect of the magnetic field on the extraction recovery was studied. The performance of the enzyme preparation in the bread making process was investigated by biochemical characterization of the purified amylase. Findings: During the purification of amylase enzyme by TPP technique, salt, organic solvent, pH, time and temperature were first optimized. As a result of TPP performed at pH 9.0, 1.0:1.5 (culture broth:t-butanol ratio), a concentration of 30% ammonium sulfate, at 30oC for 60 minutes, the enzyme was purified 1.84-fold with a yield of 105%.As a result of a series of experiments performed by varying the magnetic field duration, duty cycle and magnetic field strength with MFTPP applied for the first time, 3.07-fold purification was achieved with 195% efficiency at 10 min , 30% and 70W , respectively. The molecular weight of the enzyme was calculated as ~68.7 kDa by SDS-PAGE. The optimum pH for the amylase enzyme was 7,0 and the optimum temperature was 50oC. It was determined that the enzyme maintained its activity above 40% at 30 and 60 minutes at all values in the temperature range of 20-90o C. It was determined that the enzyme remained highly stable in the presence of surfactants at 1% and 5% concentrations, organic solvents used at 10% and 30% concentrations increased the activity, and the enzyme activity increased in the presence of Fe2+, Mn2+, Zn2+ and Mg2+ metals. Km, Vmax, Kcat, and Kcat/Km values of B. licheniformis SO5 enzyme for wheat starch substrate were calculated as 1.19 μM, 3.42 μmol.mL-1.dk-1, 1.425 s-1 and 1.2 s-1.mM-1, respectively. In addition, baking tests were carried out with the purified amylase enzyme to investigate its potential for use in the bakery industry and it was determined that the enzyme used contributed to leavening, bread shape and softness on bread. Conclusion: Today, there is a strong demand for advanced separation techniques to purify biomolecules. This is because an efficient purification process is one of the most important steps in production and accounts for a significant portion of the total cost. Consequently, in this thesis, magnetic field assisted TPP was found to be an efficient and novel technique for the partial purification of α-amylase in a short time with high yield. Furthermore, the activity and stability of B. licheniformis SO5 α-amylase over a wide range of temperature and pH, its relatively high stability in the presence of various metal ions, organic solvents and surfactants, and its potential for use in bread making indicate that this enzyme is a suitable candidate for many industrial applications, especially food.
Benzer Tezler
- Termofilik Bacillus licheniformis bakterisinden β - galaktosidaz enzim üretimi
Production of β-galactiosidase enzyme from Thermophilicbacillus lycheniformis bacteria
ELİF GİZEM COŞGUNARAS
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
BiyomühendislikKafkas ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ CEM ÖZİÇ
- Termofilik Bacillus Licheniformis bakterisinden fitaz enzim üretimi
Production of fi̇tase enzyme from thermophilic Bacillus Licheniformis bacteria
SERAP ŞABAHAT
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
BiyomühendislikKafkas ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ CEM ÖZİÇ
- Termofilik Bacillus licheniformis'ten saflaştırılan ekstrapolisakkarit'in (EPS) fizikokimyasal özelliklerinin belirlenmesi
Determination of physicochemical properties of extrapolysaccaride (eps) from thermophilic bacillus licheniformis
ÖZLEM ÇETİN
Yüksek Lisans
Türkçe
2016
BiyolojiPamukkale ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NAZİME MERCAN DOĞAN
YRD. DOÇ. DR. GÜLÜMSER ACAR DOĞANLI
- Termofilik Bacillus licheniformis KG9'da ekstrasellüler ß-galaktozidaz enzimi üzerine çalışmalar
Studies on the extracellular ß-galactosidase enzyme in the thermophilic Bacillus licheniformis KG9
ALEVCAN KAPLAN
- Termofilik Bacillus licheniformis KG9'a ait ß-galaktosidaz geninin Escherichia coli'ye aktarılması ve enzimin karakterizasyonu
Cloning of ß-galaktosidase gene of thermophilic Bacillus licheniformis KG9 to Escherichia coli and its characterization
FATMA MATPAN BEKLER