Geri Dön

İnsan akciğer fibroblastlarında kollagen sekresyon vesiküllerinin taşınmasından sorumlu moleküllerin belirlenmesi

Identification of molecules responsible for the transport of collagen secretion vesicles in human lung fibroblasts

PDF İndir

  1. Tez No: 800530
  2. Yazar: RESUL KIYMAZ
  3. Danışmanlar: PROF. DR. FÜSÜN ÖZTAY
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2023
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: İstanbul Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 103

Özet

Fibrozis, başta kollagen ve fibronektin proteinleri olmak üzere, ekstrasellülar matriks (ECM) elemanlarının aşırı miktarda üretimi ve interstisiyel alanda birikimi ile karakterize edilen patolojik bir durumdur. Akciğer dahil, deri, karaciğer, böbrek ve kalp olmak üzere pek çok organda görülebilmektedir. Kollagen, fibrotik odaklarda birikerek dokunun sertleşmesine ve scar doku oluşumuna neden olur. Salgı proteinlerinin hücre içinde taşınmasında kinesin motor proteinleri (KIF) görev alır. Farklı KIF'lerin farklı salgı moleküllerini taşıyan sekresyon vesiküllerine bağlandıkları düşünülmektedir. Pulmoner fibrozise katkı sağlayan akciğer fibroblastlarında, kollagen içeren sekresyon vesiküllerinin hücre periferine taşınmasından sorumlu KIF'ler bilinmemektedir. Çalışmamızda, insan akciğer fibroblastlarında (MRC-5 hücreleri) ve interstisiyel akciğer hastalarından alınan fibrotik akciğer örneklerinde kollagen taşınmasından sorumlu KIF proteinlerinin ve onların muhtemel regülatör proteinlerinin belirlenmesine odaklanılmıştır. Transforme edici büyüme faktörü-beta (TGF-β, 1ng/ml) ile kollagen sentezi ve sekresyonu uyarılan MRC-5 hücreleri, uyarımı takip eden 24, 48 ve 72. saatlerde toplandılar. Hücrelerden ve medyumdan RNA ve protein izolasyonları yapıldı. Kollagen taşınımı ile ilişkili olabilecek KIF'leri kodlayan genlerin mRNA seviyeleri qRT-PCR ile belirlendi. Ayrıca, hücresel ve salgılanan kollagen ve fibronektin miktarları ile hücrelerdeki KIF5A, kinesin bağlayıcı protein (KBP) ve mikrotübül ile ilişkili protein-7 (MAP7) seviyeleri Western emdirim yöntemi ile belirlendi. PCR sonuçlarına göre seçilen KIF genlerinin farklılaşmış gen ifade düzeyleri, idiyopatik pulmoner fibrozisli hastalarının primer akciğer fibroblastlarına ait RNA dizileme verileri kullanılarak karşılaştırıldı. Ayrıca, fibrotik ve fibrotik olmayan insan akciğerlerinde İNSAN AKCİĞER FİBROBLASTLARINDA KOLLAGEN SEKRESYON VESİKÜLLERİNİN TAŞINMASINDAN SORUMLU MOLEKÜLLERİN BELİRLENMESİ xiv kollagen, fibronektin, KIF5A, KBP ve MAP7 protein seviyeleri yanı sıra Co-IP analizleri ile KIF5A/MAP7 ve KIF5A/KBP fiziksel etkileşimleri belirlendi. TGF-β uyarımını takip eden zaman diliminde deneyin 24. saatinden itibaren kollagen ve fibronektin gibi ECM elemanlarının sentezi ve deneyin 48 ve 72. saatlerinde bu moleküllerin hücrelerden sekresyonu arttı. Kollagen sentezi ve hücreden salgılanmasının yüksek olduğu zaman diliminde, salgı vesiküllerin taşınmasında etkiliği olabileceği düşünülen KIF'lerden KIF3A, KIF3B, KIF5A, KIF13A, KIF13B ve KIFC3 genlerinin ifade düzeylerinin arttığı belirlendi. Bu KIF'ler arasından, hücrede kollagen geninin transkripsiyonunun, protein miktarının artış gösterdiği ve salgılanmak üzere hücre periferine taşındığı zamanlarda ekspresyonları artış gösterenler dikkate alındığında, KIF5A'nın ifade düzeyinin değişimlerin hücre içi kollagen sentezindeki ve hücre içi taşınımla paralel değişimler (artış yönünde) sergilediği tespit edildi. Miyofibroblast farklılaşmasının uyarıldığı MRC-5 hücrelerinde KBP protein miktarı ilk 24 saatte artarken, daha sonra kollagen sekresyon granüllerinin hücre periferine taşınımının ve hücreden sekresyonunun arttığı zamanlarda (deneyin 48 ve 72. saatlerinde) azaldı. TGF-β ile uyraılan MRC-5 hücrelerinde MAP7 proteinin varlığı tespit edilmedi. İnsan fibrotik akciğerleri üerinde yapılan analizler, fibrotik akciğerlerde kontrollere kıyasla daha yüksek miktarda KIF5A, KBP ve MAP7 olduğunu gösterdi. Ayrıca, insan akciğerlerinde yapılan Co-KIF5A IP analizleri ile KIF5A ve KBP arasında fiziksel bir etkileşimin varlığını ortaya koydu. Çalışmamzın verileri dikkate alındığında, TGF-β ile uyarılan MRC-5 hücrelerinde ve fibrotik insan akciğerlerinde kollagenin salgılanmak üzere hücre periferine taşınmasında KIF5A ve KBP'nin birlikte görev alabileceği ve bu süreçte KBP'nin KIF5A'nın negatif regülatörü olarak KIF5A aracılı kollagen taşınımını regüle edebileceğini düşünülmektedir. İnsan akciğer fibroblastlarında kollagenin salgılanmak üzere hücre periferine taşınmasının önlenmesinde KIF5A ve KBP'nin bu yeni anti-fibrotik tedavi yaklaşımı için hedef moleküller olarak önerilebilir.

Özet (Çeviri)

Fibrosis is a pathological condition characterized by excessive production and accumulation of extracellular matrix (ECM) elements, mainly collagen and fibronectin proteins, in the interstitial space. It can be seen in many organs, including the lung, skin, liver, kidney, and heart. Collagen accumulates in fibrotic foci and contributes to the hardening of the tissue and scar tissue formation. Kinesin motor proteins (KIF) are involved in the transport of secretory proteins inside the cell. Different members of KIFs are thought to bind to secretory vesicles carrying different secretion molecules. However, the KIFs responsible for transporting collagen-containing secretion vesicles to the cell periphery are unknown in lung fibroblasts contributing to pulmonary fibrosis. In the current study, the KIF proteins responsible for collagen transport and their possible regulatory proteins were investigated in human lung fibroblasts (MRC-5 cells) and fibrotic lung samples from patients with interstitial lung diseases. Collagen synthesis and secretion were stimulated by transforming growth factor-beta (TGF-β, 1ng/ml) in MRC-5 cells. They were harvested at 24, 48, and 72 hours after stimulation. RNAs and proteins were isolated from cells and medium. The mRNA levels of genes encoding KIFs that may be associated with collagen transport were determined by qRT-PCR. In addition, cellular and secreted collagen and fibronectin amounts and KIF5A, kinesin-binding protein (KBP), and microtubule-associated protein-7 (MAP7) levels in cells were assayed by Western blotting. Altered gene expression levels of KIF genes selected based on PCR results were compared using the RNA-seq data of primary lung fibroblasts of patients with idiopathic pulmonary fibrosis. In addition, collagen, fibronectin, KIF5A, KBP, and MAP7 protein levels and possible physical interactions of KIF5A/MAP7 and KIF5A/KBP were determined by Western blot and Co-KIF5A-IP analyses in fibrotic and non-fibrotic human lungs. IDENTIFICATION OF MOLECULES RESPONSIBLE FOR THE TRANSPORT OF COLLAGEN SECRETION VESICLES IN HUMAN LUNG FIBROBLASTS xvi Following TGF-β stimulation, the synthesis of ECM elements such as collagen and fibronectin increased from the 24th hour of the experiment, and the secretion of these molecules from the cells at the 48th and 72nd hours. Furthermore, it was determined that the expression levels of KIF3A, KIF3B, KIF5A, KIF13A, KIF13B, and KIFC3 genes are thought to be effective in the transport of secretory vesicles increased during the stage when collagen synthesis and secretion from the cell were high. We detected that the alterations (in the direction of increase) in the expression level of KIF5A were in parallel with the alterations in the intracellular collagen synthesis and intracellular transport, taken into consideration among all KIFs, having induced gene expression when the transcription and translation of the collagen gene, and its transport to the periphery of the cell for secretion. In MRC-5 cells, which differentiate into myofibroblast, the level of KBP protein increased in the first 24 hours, then it decreased when the transport of collagen secretion granules to the cell periphery and their secretion from the cell increased (at 48 and 72 hours of the experiment). MAP7 protein was not detected in MRC-5 cells stimulated with TGF-β. Analyzes on human fibrotic lungs showed increased KIF5A, KBP, and MAP7 levels in fibrotic lungs compared to controls. Also, analyses of Co-KIF5A-IP in human lungs revealed the existence of a physical interaction between KIF5A and KBP. The current study's data revealed that KIF5A and KBP might transport collagen to the cell periphery for secretion in MRC-5 cells stimulated with TGF-β and fibrotic human lungs. Additionally, KBP can regulate KIF5A-mediated collagen transport in the cell as a negative regulator of KIF5A. Therefore, KIF5A and KBP can be suggested as target molecules for this novel anti-fibrotic treatment approach in preventing collagen transport to the cell periphery for secretion in human lung fibroblasts.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    595923

    Deltametrin ve thiakloprid insektisit karışımının insan akciğer fibroblastlarında oksidatif stes potansiyelinin ve hücre canlılığına etkisinin belirlenmesi

    Determining of oxidative stress potential and effect on cell viability of deltamethri̇n and thi̇aclopri̇d insecticides in human lung fibroblasts

    ALPEREN KARABIYIK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    BiyolojiOrdu Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. VEDAT ŞEKEROĞLU

  2. Tez No

    610479

    Farklı nanopartiküler sistemler ve polimerik nanofiberler ile hazırlanan kombinasyon ürünlerinin geliştirilmesi

    Development of combination products prepared with different nanoparticular systems and polymeric nanofibers

    GÜLÇİN ARSLAN AZİZOĞLU

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    Eczacılık ve FarmakolojiEge Üniversitesi

    Farmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. KEVSER ÖZGEN ÖZER

  3. Tez No

    275094

    Genetic and epigenetic targets in liver cancer

    Karaciğer kanserinde genetik ve epigenetik hedefler

    HALUK YÜZÜGÜLLÜ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    Genetikİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET ÖZTÜRK

  4. Tez No

    743560

    İdiyopatik pulmoner fibrozisin mimiklenmesi için çok fonksiyonlu dinamik mikroakışkan platform geliştirilmesi

    Development of a multifunctional dynamic microfluidic platform for mimicking idiopathic pulmonary fibrosis

    ECEM SAYGILI

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    BiyomühendislikEge Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ÖZLEM YEŞİL ÇELİKTAŞ

  5. Tez No

    157312

    Lobektomi sonrası insan akciğer dokusunun farklı CD'lerle immünohistokimyasal analizi

    The immunohistochemical analysis of human lung tissue with variety cd's after lobectomy

    METİN KORKMAZ

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2004

    MorfolojiDicle Üniversitesi

    Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ.DR. MURAT AKKUŞ

Geri Dön