The role of MLL1-MENIN complex in somatic cell reprogramming
MLL1-MENIN kompleksinin somatic hücre yeniden programlanmasındaki rolü
- Tez No: 816849
- Danışmanlar: PROF. DR. TEVFİK TAMER ÖNDER
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Moleküler Tıp, Biology, Molecular Medicine
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2023
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Koç Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 84
Özet
OCT4, SOX2, KLF4 ve MYC (OSKM), ifadesi somatik hücreleri pluripotensiye yeniden programlayabilir. Bu süreç hücre kimliğiyle ile alakalı gen ağının tamamen yeniden düzenlenmesi ile gerçekleşir. Fakat, hücre kimliğini koruyan kromatin-bazlı mekanizmalar yeniden programlamanın düşük verimlilikte olmasına neden olur. Bu tip bariyerleri belirlemek için CRISPR-Cas9 yardımıyla susturma taraması gerçekleştirildi. Bu tarama sonucunda MLL1 yeniden programlamayı engelleyen güçlü bir bariyer olarak ortaya çıktı. Bu çalışma kapsamında, kimyasal ve genetik yaklaşımlar ile MLL1'in MENIN proteiniyle oluşturduğu kompleksin bariyer özelliği karakterize edildi . İlk olarak MLL1-MENIN kompleksin yeniden programlamaya bariyer özelliği gösterdiğini doğrulamak için bu kompleksi hedefleyen bir inhibitörü, VTP50469, kullanarak yeniden programlama veriminin arttığını doğrulandı. Sonrasında CRISPR-Cas9 yardımıyla MEN1 ve MLL1 genleri susturulmuş hücre hatları oluşturuldu. Oluşturulan bu hücre hatlarıyla yapılan yeniden programlama deneyleriyle MLL1 ve MENIN proteinlerinin ikisinin de yeniden programlama verimini arttırdığı gözlemlendi. Bu kompleksin bariyer özelliğini daha iyi anlayabilmek için MEN1 geni susturulmuş hücrelerde farklı nokta mutasyonları ifade ettirilmiştirdi. Bu hücrelerle yapılan yeniden programlama deneyleri MENIN ve MLL1 etkileşiminin MENIN'in bariyer fonksiyonu için oldukça önemli olduğunu göstermeye ek olarak, MENIN proteinin JUND gibi başka proteinlerle de etkileşime girerek somatik hücre yeniden programlanmasına engelliyor olabileceğine işaret etti. Ayrıca, MENIN inhibisyonunda ve susturulmasında gerçekleşen transkripsiyonel değişiklikleri belirlemek için RNA sekanslaması gerçekleştirdik. RNA sekanslama sonuçları aralarında geç yeniden programlama evrelerinde ifade edilmeye başlayan genleri de içeren pluripotensi ile alakalı genlerin MENIN inhibisyonunda ve susturulmasında daha fazla ifade edildiğini gösterdi. Bununla uyumlu bir şekilde, MENIN aktivitesi olmadığında fibroblast kimliği ile alakalı geniş bir gen setinin de ifadesinin azaldğını gösterdik. Ek olarak, DOT1L inhibisyonunun VTP50469 uygulamasıyla veya MEN1 susturulmasıyla ilave bir etkisinin olmadığı gözlemlendi. Son olarak, bu kompleksin aynı zamanda konvansiyonel“primed”kök hücrelerin naif pluripotensiye dönüştürülmesinde de bariyer özelliği gösterdiği tespit edilmiştir. Naif hücre ortamına VTP50469 eklenmesi naive kök hücre eldesini daha güçlü hale getirmiştir. Bu durum MLL1-MENIN kompleksinin insan naif pluripotensisini modüle etmek etmek için uygun bir hedef olduğunu göstermektedir. Hepsi birden düşünüldüğünde, MLL1-MENIN kompleksinin daha yüksek gelişimsel potansiyelli hücre kimliklerinin kazanılmasında bariyer oluşturduğu gösterilmiştir.
Özet (Çeviri)
Expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC (OSKM) can reprogram somatic cells to pluripotency. This process involves a complete reset of the somatic cell identity. However, chromatin-based mechanisms that safeguard cellular identities act as barriers to reprogramming, resulting in low efficiency of cell fate conversions. To identify such barriers, a loss of function genetic screen has previously been performed and MLL1 (KMT2A) was identified as a significant roadblock for reprogramming. In the scope of this work, we employed chemical and genetic approaches to characterize the effects of MLL1 in complex with MENIN on reprogramming of human somatic cells. Firstly, we validated the barrier function of this complex via utilizing an inhibitor, VTP50469, that selectively targets MLL1-MENIN complex, which led to increased reprogramming efficiency. Next, we generated fibroblast cell lines that express Cas9 and gRNAs targeting MLL1 and MEN1 genes. Reprogramming experiments with these cell lines showed that deletion of both MEN1 and MLL1 increase the efficiency of reprogramming significantly. To further understand the barrier function of this complex, we tested the rescue capabilities different MEN1 point mutants by overexpressing their cDNAs in MEN1 KO cells. These experiments showed that while MLL1 interaction is crucial for MENIN barrier function, MENIN might be interacting with additional proteins such as JUND to prevent reprogramming. Furthermore, we observed that DOT1L inhibition does not further enhance the reprogramming efficiency when combined with VTP50469 treatment or MEN1 depletion. This suggests that DOT1L-related mechanisms might be involved in the prevention of somatic cell reprogramming. Moreover, we performed RNA-sequencing to identify the transcriptional changes that place in MENIN inhibition and depletion. RNA-sequencing results showed that, compared to the controls, several of pluripotency genes which include genes that are usually expressed in late reprogramming are upregulated both in the context of MENIN inhibition and depletion. In line with that, we observed that a large set of fibroblast-specific genes are downregulated in the absence of MENIN activity. Additionally, we also showed that this complex imposes a barrier function during the resetting of primed pluripotent stem cells to naive pluripotency. The supplementation of the naive culture conditions with VTP50469 enhanced the induction naive pluripotent stem cells. This suggests that MLL1-MENIN inhibition is a feasible target for modulating human naive pluripotency. Taken together, the results represented herein shows that MLL1-MENIN complex imposes barriers in the acquisition of cell identities of higher developmental potential.
Benzer Tezler
- Determining the effects of DOT1L interacting proteins on cellular reprogramming
DOT1L ile etkileşen proteinlerin hücrenin yeniden programlama tekniğine etkilerinin belirlenmesi
DENİZ UĞURLU ÇİMEN
Doktora
İngilizce
2018
Moleküler TıpKoç ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. TEVFİK TAMER ÖNDER
- Ventrikül kasılmasında oksidan stresin rolünün elektrofizyolojik olarak incelenmesi
The Role of oxidant stress on ventricular contraction by electrophysiological methods
ÖMER HOTOMAROĞLU
- The Role of aid NGO's as non-state actors in international politics
Yardım amaçlı sivil toplum kuruluşlarının devlet dışı aktörler olarak uluslararası politikadaki rolü
BANU İŞLET
Yüksek Lisans
İngilizce
1998
Siyasal BilimlerMarmara ÜniversitesiSiyaset Bilimi ve Uluslararası İlişkiler Ana Bilim Dalı
PROF. AKİLE GÜRSOY
- The role of state aids in the European Community and the impacts of the customs union on the Turkish state aids system
Avrupa Topluluğu'nda devlet yardımlarının rolü ve gümrük birliğinin Türk devlet yardımları sistemi üzerindeki etkileri
ASLI DENİZ HELVACIOĞLU
- İş sağlığı ve güvenliğinin sağlanmasında işçi kesiminin rolü
The Role of workers in occupational health and safety
ÖZGÜR ÖZTÜRK
