Functional roles of two chromatin factors (USP22 ve MENIN) in reprogramming and pluripotency
İki kromatin faktörünün (USP22 ve MENIN) yeniden programlamada vepluripotensideki fonksiyonel rolleri
- Tez No: 928235
- Danışmanlar: PROF. DR. TEVFİK TAMER ÖNDER
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Tıbbi Biyoloji, Medical Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Koç Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Hücresel ve Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Hücresel ve Moleküler Tıp Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 84
Özet
OCT4, SOX2, KLF4 ve C-MYC (OSKM) faktörlerinin anlatımı somatik hücreleri uyarılmış pluripotent kök hücrelere (uPKH) yeniden programlayabilir. Somatik hücre kimliğini koruyan hücre içi bariyerlerin olması sebebiyle somatik hücre yeniden programlanması düşük verimli bir süreçtir. Daha önce gerçekleştirilen CRISPR-Cas9 bazlı susturma taraması ile USP22 ve MLL1 genleri yeniden programlama bariyerleri olarak ortaya çıkarıldı. Bu tezin birinci bölümünde, USP22 geni susturulmuş hücre hatlarının üzerine yabanıl tip ve katalitik mutant USP22'nin tekrar anlatılmasıyla, yeniden programlamadaki değişimin USP22 kaybıyla ilgili olduğu ve bu etkinin USP22'un katalitik aktivitesinden bağımsız olduğu kanıtlandı. USP22'nin fibroblast hücre hatlarında susturulması ve bu hatların farklı 'primed' kültür koşullarında yeniden programlanması ile, artan yeniden programlama veriminin hücre hattı ve kültür koşullarından bağımsız olduğu kanıtlandı. Yeniden programlamanın belirli zamanlarında yapılan transkriptom analizi, USP22'nin susturulmasının COL1A2, POSTN, FOXC2 gibi somatik hücreye özgü genlerin yeniden programlama boyunca baskılanmasına yol açtığını ortaya çıkardı. Ek olarak, 3. gün gibi çok erken bir zamanda bile, USP22 kaybının SOX2, LIN28A gibi genel pluripotent genlerinin ve DNMT3L, GDF3, ALPPL2, ARGFX gibi 'naive' pluripotent genlerinin ifadesinin artmasına sebep olduğunu ortaya çıkarıldı. USP22'nin rolünün naive pluripotensiye ulaşmadaki rolünü araştırmak üzere somatik hücrelerden naive yeniden programlama deneyi yapıldı ve sonuç olarak TRA-1-60/KLF17 çift boyama ile belirlenen naive kolonilerin nicelik olarak arttığı gözlemlendi. Ek olarak, geçiş sırasındaki DNMT3L ve ALLPL2 gibi naive pluripotensi genlerinin anlatımındaki artıştan yola çıkarak USP22 kaybının primed pluripotensiden naive pluripotensisine geçişin verimliliğini arttırdığı ortaya kondu. İkinci bölümde, MEN1 geninin susturulmasının farklı fibroblast hücre hatlarında yeniden programlama verimini artırdığı gösterildi. H3K79me2 kromatin işaretini okuyamayan H433A nokta mutantı MENIN'in yeniden kurtarma deneylerinde kullanılmasıyla, MENIN'in yeniden programlamadaki bariyer fonksiyonunun kısmi olarak bu aktivitesiyle ilgili olduğu belirlendi. MEN1'in susturulmasının pluripotensiye etkisini kontrol etmek için, MEN1 geni susturulmuş fibroblastlardan tek klondan büyüyen uPKH hatları üretildi. Karakterizasyon deneyleri bu klonların endojen OCT4, SOX2 ve KLF4 genlerini ifade ettiklerini, aynı zamanda transgenik C-MYC genini susturulduğunu gösterdi. Ayrıca, bu klonların stabil olarak pluripotensi ile ilgili proteinleri ifade ettiği ve teratom oluşumu deneyine tabii tutulduğunda, üç embriyonik tabakadan dokulara farklılaşabildiği gösterildi. Son olarak, VTP50469 kimyasalı kullanarak MENIN-MLL1 Kompleksi inhibisyonunun fibroblast hücre hatlarında yeniden programlama verimini artırdığı gözlemlendi. Ek olarak, VTP50469 3-faktörlü (OSK) yeniden programlamanın verimini artırdı ve yalnızca 2-faktör (OS) kullanarak uPKH üretimine olanak sağladı. Sonuç olarak, bu çalışma 2 farklı kromatin faktörünün yeniden programlama ve pluripotensideki önemli rollerini göstermektedir.
Özet (Çeviri)
Overexpression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC (OSKM) factors can reprogram somatic cells to induced pluripotent cells (iPSC). Process of somatic cell reprogramming is inherently inefficient, pointing to the cell's intrinsic barriers that safeguards somatic cell identity. Previously conducted CRISPR-Cas9-based knockout screens during reprogramming revealed USP22 and MLL1 as barriers to reprogramming. In the first part of this thesis, overexpression of wild-type and catalytic mutant USP22 in USP22 KO cell lines were performed which showed that increased reprogramming efficiency is indeed related to USP22 loss, and this effect is not related to its deubiquitination activity. Reprogramming of USP22 knock-out primary fibroblasts under different primed pluripotency culture conditions proved that increased reprogramming efficiency is independent of cell line or culture condition of choice. Transcriptome analysis at specific time-points during reprogramming revealed that loss of USP22 represses fibroblast-specific genes such as COL1A2, POSTN, FOXC2 that occurs throughout reprogramming. In addition, USP22 loss results in upregulation of general pluripotency markers such as SOX2, LIN28A and naïve pluripotency markers such as DNMT3L, GDF3, ALPPL2, ARGFX as early as 3 days after OSKM expression. To investigate a potential role of USP22 in attaining naïve pluripotency, I reprogrammed somatic cells under naïve culture conditions which resulted in an increased number of naïve colonies as quantified by TRA 1-60/KLF17 double staining. In addition, USP22 loss enhanced conversion from primed to naive pluripotency indicated by higher expression levels of naive pluripotency markers DNMT3L and ALPPL2. In the second part of the thesis, I showed that MEN1 loss enhances reprogramming efficiency in primary fibroblasts. Rescue experiments utilizing overexpression of H433A mutant MENIN which cannot recognize H3K79me2, indicated that MENIN acts as a barrier partially through its ability to read this chromatin mark. To test whether knocking-out MEN1 affects pluripotency, single clone iPSCs were generated from MEN1 KO fibroblasts. Characterization assays showed that these clones express endogenous OCT4, SOX2 and KLF4 while silencing C-MYC and other exogenous transgenes. Also, MEN1 iPSCs stably express pluripotency related proteins and contribute to all three germ layers when subjected to teratoma formation assay. Finally, MENIN-MLL1 Complex inhibition via VTP50469 enhanced reprogramming efficiency in primary fibroblast lines. In addition, VTP50469 supplementation increased reprogramming efficiency of 3-factor (OSK) reprogramming, and enabled iPSC generation with only 2 factos (OS). Taken together, this work demonstrates important roles for two distinct chromatin factors in reprogramming and pluripotency.
Benzer Tezler
- Determining the effects of DOT1L interacting proteins on cellular reprogramming
DOT1L ile etkileşen proteinlerin hücrenin yeniden programlama tekniğine etkilerinin belirlenmesi
DENİZ UĞURLU ÇİMEN
Doktora
İngilizce
2018
Moleküler TıpKoç ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. TEVFİK TAMER ÖNDER
- Development & application of novel methods to identify locus-specific transcriptional regulators
Lokusa özgü transkripsiyonel faktörlerin keşfi için yeni metotların geliştirilmesi ve uygulanması
İPEK SELCEN
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
BiyolojiBoğaziçi ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. NEŞET CEVDET TOLGA EMRE
- Role of DNA topoisomerase IIβ in osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells
İnsan mezenkimal kök hücrelerinin osteogenik farklılaşmasında DNA topoizomeraz IIβ'nın rolü
AYSEL KARAGÖZ
Doktora
İngilizce
2017
Genetikİstanbul ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. BEDİA PALABIYIK
- Transcription factor CUX1-regulated gene expression in the developing cortex
Gelişen kortekste transkripsiyon faktörü CUX1'ın düzenlediği gen ifadeleri
FİLİZ SILA RIZALAR
Yüksek Lisans
İngilizce
2017
BiyolojiKoç ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. GÜLAYŞE İNCE DUNN
- Understanding how loss of histone H3 lysine 36 trimethylation enhances somatic cell reprogramming
Histon H3 lizin 36 üç-metil kaybının somatik hücre yeniden programlamasını nasıl geliştirdiğinin anlaşılması
BÜŞRA BAYIRBAŞI
Yüksek Lisans
İngilizce
2021
GenetikKoç ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. TEVFİK TAMER ÖNDER