Recombinant production and biochemical analysis of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase for drug development studies
İlaç gelıştirme çalışmaları için 1-deoksi-D-selüloz 5-fosfat redüktoizomerazın rekombinant üretimi ve biyokimyasal analizi
- Tez No: 847213
- Danışmanlar: PROF. DR. DİLEK BALIK, PROF. DR. BJÖRN WINDSHÜGEL
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyomühendislik, Bioengineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2024
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Yıldız Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyomühendislik Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 116
Özet
Antimikrobiyal direnç, 2050 yılına kadar yılda tahmini 10 milyon ölümle, önde gelen ölüm nedenlerinden biri olma potansiyeline sahiptir. Farkındalığı artırmak ve sorunun aciliyetini vurgulamak amacıyla DSÖ, acilen yeni antimikrobiyallerin geliştirilmesine ihtiyaç duyan patojenlerin bir listesini yayınlamış ve belsoğukluğu etkeni Neisseria gonorrhoeae, yüksek öncelikli patojen olarak kategorize edilmiştir. Yüksek ökaryotlarda ve bakterilerde hayati önem taşıyan hücresel izoprenoid öncüllerinin sentezinde farklı yolaklar yer alır ve bu da biyosentetik yolakların ilaç hedefi olarak kullanılmasını sağlar. N. gonorrhoeae dahil olmak üzere çoğu bakteri metil eritritol 4-fosfat yolağını (MEP) kullanır. Yolaktaki ikinci adım, 1-deoksi-D-ksilüloz 5-fosfatın 1-deoksi-D-ksilüloz 5-fosfat redüktoizomeraz (DXR) tarafından 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfata dönüştürülmesini içerir. Bu çalışma, yüksek verimli taramada kullanılmak üzere N. gonorrhoeae DXR'nin rekombinant üretimini ve biyokimyasal analizini amaçlamaktadır. C-terminal His etiketli NgDXR, pLATE31 ifade vektör sistemi kullanılarak Escherichia coli BL21(DE3)'te ifade edilmiştir. Üretilen protein, çözünür formda düşük miktarlarda elde edilmesine rağmen, esas olarak pelet fraksiyonunda gözlenmiştir. Çözünür proteinin ekspresyon verimini artırmak için çok sayıda strateji uygulanmasına rağmen, eksprese edilen proteinin biyokimyasal analiz için yeterli olmadığı belirlenmiştir. Literatür taramasına ve DXR amino asit dizilerinin çoklu dizi hizalama analizine dayanarak, E. coli DXR'nin aktif bölge fonksiyonel kalıntılarının NgDXR'de korunduğu gözlenmiştir. Sonuç olarak, EcDXR'nin rekombinant üretimi amaçlanmış ve E. coli BL21(DE3) konak suşunda pLATE31 vektör sistemi kullanılarak protein ekspresyonu 30°C'de 3 saat boyunca 0,5 mM IPTG indüksiyonu ile gerçekleştirilmiştir. % 95'in üzeri saflıkta elde edilen EcDXR, biyokimyasal analize tabi tutulmuş, Km ve Vmax değerleri sırasıyla 103,4±17,05 μM ve 0,5985±0,03497 μmol/dk.mg olarak belirlenmiştir. Fosmidomisin (FSM) ile yapılan inhibisyon çalışması sonucunda, FSM'nin EcDXR'ye karşı IC50 değeri 160 nM olarak belirlenmiştir. Tez kapsamında, insanlarda eşdeğeri bulunmayan ve yüksek konsantrasyonlarda elde edilebilen rekombinant olarak üretilmiş EcDXR'nin ilaç geliştirme çalışmalarında kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.
Özet (Çeviri)
Antimicrobial resistance, has the potential to become a primary leading cause of death, with an estimated 10 million deaths per year by 2050. To increase awareness and emphasize the urgency of the problem, the WHO published a list of pathogens that urgently need the development of new antimicrobials and the causative agent of gonorrhea, Neisseria gonorrhoeae, was categorized as a high-priority pathogen. Distinct pathways are involved in the synthesis of vital cellular isoprenoid precursors in higher eukaryotes and bacteria, enabling biosynthetic pathways to be used as drug targets. Most bacteria, including N. gonorrhoeae, utilize the methylerythritol 4-phosphate pathway (MEP). The second step in the pathway involves the conversion of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate to 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate by 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase (DXR). This study aims recombinant production and biochemical analysis of N. gonorrhoeae DXR with the ultimate purpose of being used in high-throughput screening. C-terminal His-tagged NgDXR was expressed in Escherichia coli BL21(DE3) using the pLATE31 expression vector system. Although the protein produced was obtained in low amounts in soluble form, it was mainly observed in the pellet fraction. Numerous strategies were applied to improve the expression yield of the soluble protein; nevertheless, the expressed protein was still insufficient for biochemical analysis. Based on the literature review and multiple sequence alignment analysis of DXR amino acids sequences, the active site functional residues of E. coli DXR were observed to be conserved in NgDXR. Consequently, the recombinant production of EcDXR was aimed, and protein expression using the pLATE31 vector system in E. coli BL21(DE3) host strain was performed with 0.5 mM IPTG induction at 30°C, for 3 hours. The EcDXR with purity over 95% was subjected to biochemical analysis, the Km and Vmax values were determined as 103.4±17.05 μM and 0.5985±0.03497 μmol/min.mg, respectively. As a result of the inhibition study with fosmidomycin (FSM), the IC50 value of FSM against EcDXR was determined as 160 nM. Within the scope of the thesis, it was concluded that recombinantly produced EcDXR, which has no equivalent in humans and can be obtained at high concentrations, may be used in drug development studies.
Benzer Tezler
- Recombinant production and characterization of chitinase enzyme from Pseudomonas mandelii KGI_MA19
Pseudomanas mandelii KGI_MA19 organızmasına ait kitinaz enziminin rekombinant üretimi ve karakterizasyonu
EMİNE TUĞÇE SARAÇ CEBECİ
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
- Recombinant production and characterization of serine protease enzyme from Virgibacillus sp. AGTR strain using site directed mutagenesis
Virgibacillus sp. AGTR suşundan izole edilen serin proteaz enziminin bölgeye yönelik mutagenez yöntemi kullanılarak rekombinant üretimi ve karakterizasyonu
EVRİM KAPUCU
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
Biyokimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
- Toxoplasma gondii FabG (3-Oxoacyl-[Acyl-Carrier-Protein] Reductase) enziminin ilaç geliştirmeye yönelik olarak rekombinant üretimi, biyokimyasal, biyofiziksel ve In Silico analizi
Recombinant production, biochemical, biophysical and in silico analysis of the toxoplasma gondii FabG (3-Oxoacyl-[Acyl-Carrier-Protein] Reductase) enzyme for drug development studies
CAN AYGÜN
- Geobacillus kaustophilus fosfotransasetilazın rekombinant üretimi ve biyokimyasal karakterizasyonu
Geobacillus kaustophilus phosphotransacetylase: Recombinant production and biochemical characterization
MERAL AMANVERMEZ KARABAŞ
- Protein kalite kontrolünde görev alan FtsH-HflKC protein kompleksinin yapısal biyolojisi
Structural biology of FtsH-HflKC protein complex involved in protein quality control
GÜNCE GÖÇ
Doktora
Türkçe
2024
BiyokimyaKocaeli ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. YONCA YÜZÜGÜLLÜ KARAKUŞ
DR. BURAK VELİ KABASAKAL