Geri Dön

Recombinant production and characterization of chitinase enzyme from Pseudomonas mandelii KGI_MA19

Pseudomanas mandelii KGI_MA19 organızmasına ait kitinaz enziminin rekombinant üretimi ve karakterizasyonu

PDF İndir

  1. Tez No: 740030
  2. Yazar: EMİNE TUĞÇE SARAÇ CEBECİ
  3. Danışmanlar: PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Mikrobiyoloji, Biotechnology, Microbiology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2022
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 123

Özet

Canlılık için gerekli olan biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen genellikle protein yapıda bulunan biyolojik katalizörlere enzim adı verilmektedir. Enzimler, katalizledikleri reaksiyonların aktivasyon enerjisini düşürerek reaksiyonun oluşum hızını arttırırlar. Son yıllarda, gıda, tarım, eczacılık, kozmetik, atık giderimi, deri işleme, deterjan ve tıbbi uygulamalar için farklı endüstriyel alanlarda, çevre dostu, ucuz, istenmeyen yan ürünlerin oluşumunu en aza indirgemeleri ve biyobozunur özelliğe sahip olmaları sebebiyle büyük bir paya sahiplerdir. Ayrıca temizlik, sağlık ve gıda endüstrileri için de güvenli kabul edilmektedirler. Tercih edildikleri özelliklere ek olarak, düşük/yüksek sıcaklıklarda, organik çözücülerin varlığında, farklı tuz konsantrasyonları ve pH değerlerinde aktif kalan ve farklı substratlara afinitesi olan enzimler, endüstrinin ilgisini çekmektedir. Sanayide farklı özelliklere sahip biyomoleküllerin kullanımı için artan talebin karşılanabilmesi, günümüzde tanımlanmış biyokatalizörlerin fiziksel ve biyokimyasal özelliklerinin protein mühendisliği, metagenomik, ileri DNA teknolojileri ve nanoteknoloji yardımıyla geliştirilmesi ve /veya yeni biyokatalizörlerin keşfi ile mümkündür. Özellikle, ekstrem koşullar altında yaşamını sürdüren canlılardan elde edilen enzimlerin, farklı endüstriyel alanlarda kullanılabilirlikleri nedeniyle, bilimsel araştırmalar da bu yönde hız kazanmıştır. Kitin (C8H13O5N)n, doğada en çok bulunan biyopolimerler içinde selülozdan sonra ikinci sırada yer alan, β-1,4 glikozidik bağlarla N-Asetil-D-glukozamin monomerlerinin (Glc-NAc) bağlanması ile oluşan elastikiyeti olmayan, sert, beyaz, azot içeren bir polisakkarittir. Kitin özellikle dünya üzerinde yıllık üretimi fazla olan, mantarların hücre duvarında, böceklerin dış kabuklarında, ıstakoz, yengeç, karides gibi deniz canlılarının kabuklarında, mürekkep balığı ve ahtapot gibi kafadan bacaklı canlıların ağız bölgelerinde bulunmaktadır. Gıda ve Tarım Örgütü (Food and Agriculture Organization (FAO), 2019), verilerine göre de su ürünleri yetiştiriciliğinde, 10,5 milyon kitince zengin kabuklu deniz canlısı (%12,3) yetiştirilmektedir. Her geçen gün artan miktarda oluşan kitin atıklarının, biyolojik olarak değerli ürünlere dönüştürülmesi gerekliliği ortaya çıkmaktadır. Son yıllarda, kitin atıklarının giderilmesinde çevre için toksik ve maliyet açısından da yüksek olan kimyasal proseslerin yerine biyokatalizörlerin kullanılmaya başlanması, çevre için güvenli bir dönüşümün sağlanmasına olanak tanımaktadır. Hidrolazlar sınıfında bulunan kitinaz enzimleri (EC 3.2.1.14), kitin (C8H13O5N)n içerinde bulunan β-1-4 glikozidik bağlarının yıkımını katalizler ve N-asetil-D-glukozamin moleküllerini polisakkarit zincirinden ayırırlar. Doğada yaygın bulunan kitinaz enzimi, böceklerde, bitkilerde, mantarlarda, virüslerde bulunmaktadır. Ayrıca, Aeromonas, Arthrobacter, Bacillus, Chromobacterium, Flavobacterium, Pseudomonas, Sanguibacter, Serratia ve Streptomyces gibi farklı bakteri cinslerinde de yaygın olarak bulunmaktadır. Son yıllarda artan yeşil ve çevre dostu teknoloji ile kitinazlara olan ilgi de günden güne artış göstermektedir. Tarımsal öneme sahip olan kitinaz enzimleri, biyokontrol maddesi olarak kullanılabilmesi özelliği ile tarımda kullanılan kimyasalların ve pestisitlerin yerini almaktadır. Deniz atıklarının geri dönüşümünü sağlayarak deniz ekosisteminin üzerinde olumlu bir etki yaratmaktadır. Farmasötik açıdan antifungal ve antibakteriyel özellikleri sebebiyle iltihap ve mantar önleyici ilaç, anti kanser ve bağışıklık güçlendirici ajan, yara örtüleri, kontakt lensler ve cerrahi dikişlerin üretilmesinde kullanılmaktadırlar. Gıda sanayinde ise raf ömrünün arttırılmasına yönelik olarak kullanılan biyokoruyucu katkı maddesi olarak karşımıza çıkmaktadır. Yeryüzünde en son keşfedilen, en yüksek rakıma ve en düşük sıcaklığa sahip olan Antarktika kıtası son dönemlerde popüler bir araştırma alanı olmuştur. Yakın bir geçmişe kadar insan elinin değmediği Antarktika kıtasında tatlı su kaynaklarının %70'i buz halinde bulunur. Ayrıca kuvvetli rüzgarlara, çok düşük sıcaklıklara sahiptir ve kışın düşük, yazın ise yoğun UV radyasyonuna maruz kalmaktadır. Bu nedenlerden dolayı doğal ve eşsiz bir yaşam habitatına sahiptir. Ekstrem koşulları sayesinde yeni türlerin bulunması, çeşitli enzimlerin ve genlerin keşfedilmesi kaçınılmazdır. Ekstrem koşullarda canlılıklarını sürdürebilen canlılar ekstremofiller olarak adlandırılmaktadır. Ekstremofilik canlılardan elde edilen, zor koşullar altında dahi katalitik aktivitelerini gösteren biyokatalizörler, ekstremozimler olarak literatürde yerini almıştır. Psikrofiller 0-20 °C'de, psikrotolerantlar ise 0-30 °C'de yaşamlarını sürdürebilen ekstremofilik mikroorganizmalardır. Psikrofil ve psikrotolerant canlılardan elde edilen soğuğa uyumlu enzimler ise endüstriyel uygulamalarda düşük enerji ihtiyaçları, esneklikleri ve yüksek katalitik aktiviteye sahip olmaları sebebiyle tercih edilmektedir. Biyoteknolojik araştırmalar sayesinde, Antarktika'ya ait literatürde henüz bulunmayan yeni ve çeşitli ekstremofillerin ve ekstromozimlerin keşfi devam etmektedir. 2. Ulusal Antarktika Bilim Seferi (TAE-2) kapsamında toplanan Antarktika sediment örnekleri kullanılarak gerçekleştirilen çalışmada, 8 farklı bölgeden alınmış, 12 adet sediment örneğinin kültüre edilerek zenginleştirilmesi sağlanmıştır. Ardından her bir kültüre edilmiş örneğe don-çöz stresi uygulanmıştır. Uygulanan don-çöz stresi sonrasında beş adet kültürün strese dirençli olduğu gözlemlenmiştir. Strese dirençli her bir örnekten morfolojik olarak farlılık gösteren iki adet koloni seçilerek, DNA izolasyonları yapılmış ve 16S rRNA analizleri gerçekleştirilmiştir. 16S rRNA analizine göre benzerlik oranı en düşük olan örnek tüm genom analizine gönderilmiş ve analiz sonucuna göre Pseudomonas mandelii türüne ait yeni bir suş olan Pseudomonas mandelii KGI_MA19 tanımlanmıştır. Tanımlanan KGI_MA19 suşunun fenotipik ve biyokimyasal karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Psikrotolerant bir organizma olan Pseudomonas mandelii türüne ait hidrolitik kitinaz enziminin üretimi ve biyokimyasal karakterizasyonuna yönelik çalışma literatürde henüz mevcut değildir. Pseudomonas mandelii KGI_MA19'a ait kitinaz enziminin gen bölgesi, SacI ve NotI kesim bölgeleri içeren gen spesifik primerler tasarlanarak polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılmıştır. Çoğaltılan ilgili gen bölgesi ve pET-28a (+) vektörü, SacI ve NotI restriksiyon enzimleriyle kesilmiştir. Kesimi yapılmış PZR ürünü ve ekspresyon vektörünün ligasyonu için T4 DNA ligaz enzimi kullanılmıştır. PZR ürününü içeren pET-28a (+) plazmidi, Eshericia coli BL21 (DE3) kompetant hücrelerine transforme edilmiştir. Transformasyon sonucunda ilgili geni içeren kolonilerin belirlenebilmesi için koloni PZR yöntemi uygulanmış ve pozitif olduğu düşünülen koloniler arasından seçilen iki adet koloninin plazmit izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Ardından kolonilerin gen ürününü içerip içermediğini anlayabilmek için hızlı kesim yapma özelliğine sahip EcoRV endonükleaz enzimiyle plazmidin kesimi gerçekleştirilmiştir. DNA dizileme sonuçları kitinaz genine spesifik PZR ürününün pET-28a (+) plazmidi içerisine doğru bir şekilde eklendiğini göstermiştir. Ticari olarak satılan E.coli hücrelerinin ekspresyonlarında kullanılan Magic MediaTM (Invitrogen), E.coli BL21 hücreleri içerisinde bulunan kitinaz geninin ekspresyon seviyesinin gözlemlenmesi için kullanılmıştır. Magic Media inkübasyonu sonunda hücreler lizis (0.1M Tris-HCl, pH 8,0, 0,3M NaCl) tamponu ile muamele edildikten sonra M73 probu kullanılarak ultrasonikasyon ile homojenizasyon gerçekleştirilmiştir. Yüksek miktarda üretilen kitinaz enzimi His-Trap kolonu kullanılarak His-Tag afinite kromatografisi yöntemi ile saflaştırılmıştır. Yüksek saflıkta elde edilen kitinaz enziminin aktivitesi, kolloidal kitinin substrat olarak kullanılması ile gerçekleştirilen reaksiyon sonucunda açığa çıkacağı beklenen indirgen şekerlerin miktarını belirlemeyi sağlayan 3, 5-Dinitrosalisilik asit (DNS) yöntemi ile belirlenmiştir. Optimum pH ve optimum sıcaklık, pH stabilitesi ve termal stabilitesini içeren biyokimyasal karakterizasyonu tamamlanmıştır. Bu tez çalışması kapsamında, Antarktika King George adasından alınan sediment örneklerinden yeni, psikrotolerant bir suş olan Pseudomonas mandelii KGI_MA19 suşu tanımlanmış ve moleküler, fenotipik, morfolojik ve biyokimyasal karakterizasyonu tamamlanmıştır. Ayrıca endüstriyel alanda artan öneme sahip kitinaz enzimi, rekombinant DNA yöntemleri kullanılarak başarılı bir şekilde üretilmiş ve biyokimyasal karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. İlk kez bu tez kapsamında elde edilen Pseudomonas mandelii KGI_MA19 suşuna ait soğuğa uyumlu kitinaz enziminin, endüstriyel uygulamalar için umut vadeden potansiyel bir biyokatalizör olduğu düşünülmektedir.

Özet (Çeviri)

Biological catalysts, generally found in protein structure, that catalyze the biochemical reactions necessary for life are called enzymes. They increase the reaction rate by lowering the activation energy of the reaction catalysed. In recent years, enzymes have gained a large share in different industrial areas, like food, agriculture, pharmacy, cosmetics, waste removal, leather processing, detergent, and medical applications. Enzymes can minimize the formation of unwanted by-products, they are environmentally friendly and cheap, and have biodegradable properties. They are also considered safe for the cleaning, health, and food industries. In addition to their preferred properties, enzymes that remain active at low/high temperatures, in the presence of organic solvents, at different salt concentrations and pH values, and with an affinity for different substrates are attracting the attention of the industry. Meeting the increasing demand for the use of biomolecules with different properties in the industry is possible with the development of the physical and biochemical properties of the biocatalysts defined today with the help of protein engineering, metagenomics, advanced DNA technologies, nanotechnology, and finally, the discovery of new biocatalysts. Scientific research has been increasing in this direction, especially because enzymes from living things that live in extreme conditions can be used in a wide range of industries. Chitin (C8H13O5N)n is an inelastic, hard, white, non-elastic biopolymer formed by the bonding of N-Acetyl-D-glucosamine monomers (Glc-NAc) with β-1,4 glycosidic bonds, which ranks second after cellulose among the most abundant biopolymers in nature. It is a nitrogen-containing polysaccharide. Chitin is found in the cell wall of fungi, the outer shells of insects, the shells of sea creatures such as lobster, crab, shrimp, and the mouth areas of cephalopods such as cuttlefish and octopus which have a high annual production in the world. According to the Food and Agriculture Organization (FAO, 2019) data, 10.5 million chitin-rich shellfish (12.3%) are grown in aquaculture. The need for converting chitin wastes, which are rising in quantity by the day, into biologically useful products develops. In recent years, the employment of biocatalysts in the removal of chitin wastes instead of chemical methods, which are poisonous to the environment and expensive, has allowed for a safe conversion for the environment. Chitinase enzymes (EC 3.2.1.14), in the hydrolase class, catalyse the destruction of β-1-4 glycosidic bonds in chitin (C8H13O5N)n and separate N-acetyl-D-glucosamine molecules from the polysaccharide chain. The chitinase enzyme, which is one of the most common hydrolase enzymes in nature, is found in insects, plants, fungi and viruses. It is also commonly found in different bacterial genera such as Aeromonas, Arthrobacter, Bacillus, Chromobacterium, Flavobacterium, Pseudomonas, Sanguibacter, Serratia, and Streptomyces. With the increase in green and environmentally-friendly technology in recent years, the interest in chitinases is increasing day by day. Chitinase enzymes, which have agricultural importance, replace chemicals and pesticides used in agriculture with their ability to be used as biocontrol agents. It creates a positive effect on the marine ecosystem by recycling marine waste. Due to their pharmaceutically antifungal and antibacterial properties, they are used in the production of anti-inflammatory and anti-fungal drugs, anti-cancer and immune-enhancing agents, wound dressings, contact lenses, and surgical sutures. It is a bioprotective additive used to increase shelf life in the food industry. Antarctica with the highest elevation and lowest temperature has recently become a popular research area. 70% of the freshwater resources on the Antarctic continent, which has not been touched by human hands until lately, are in the form of ice. It also features powerful winds, extremely cold temperatures, and is exposed to low temperatures in the winter and high UV rays in the summer. It has a natural and distinct habitat as a result of these factors. Because of the harsh circumstances, it is unavoidable to uncover new species and enzymes and genes. Extremophiles are living systems that can thrive in harsh environments. Biocatalysts derived from extremophilic organisms and demonstrating catalytic activity even under adverse circumstances have been dubbed extremozymes. Psychrophiles and psychrotolerants are extremophilic microorganisms that can live at 0-20 °C and 0-30 °C, respectively. Because of their low energy needs, flexibility, and high catalytic activity, cold-compatible enzymes derived from psychrophilic and psychrotolerant organisms are crucial for commercial applications. Biotechnological approaches help the identification of novel and diverse extremophiles and extremozymes from Antarctica that has not been described in the literature yet. In the study, which was carried out using Antarctic sediment samples collected within the scope of the 2nd National Antarctic Science Expedition (TAE-2), 12 sediment samples taken from 8 different regions were cultured and enriched. Subsequently, freeze-thaw stress was applied to each cultured sample. After the applied freeze-thaw stress, it was observed that five cultures were resistant to stress. Two morphologically different colonies were selected from each stress-resistant sample, DNA isolations were made and 16S rRNA analyzes were carried out. The sample with the lowest similarity rate according to 16S rRNA analysis was sent for whole-genome analysis and according to the results of the analysis, a new strain of Pseudomonas mandelii, Pseudomonas mandelii KGI_MA19, was identified. Phenotypic and biochemical characterizations of the identified KGI_MA19 strain were performed. The next step was the recombinant production and the characterization of the chitinase enzyme of the psychrotolerant Pseudomonas mandelii KGI_MA19. The gene region of the chitinase enzyme of Pseudomonas mandelii KGI_MA19 was amplified by polymerase chain reaction (PCR) by designing gene-specific primers containing SacI and NotI restriction sites. The amplified gene region of interest and the pET-28a (+) vector were cut with SacI and NotI restriction enzymes. T4 DNA ligase enzyme was used for ligation of the cut PCR product and expression vector. Plasmid pET-28a (+) containing the PCR product was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) competent cells. The colony PCR method was applied to determine the colonies containing the relevant gene as a result of the transformation, and plasmid isolation of two colonies selected from among the colonies thought to be positive was performed. Then, to understand whether the colonies contain the gene product or not, the plasmid was cut with the EcoRV endonuclease enzyme, which has a fast-cutting feature. The DNA sequencing results showed that the chitinase gene-specific PCR product was correctly inserted into the pET-28a (+) plasmid. The Magic MediaTM (Invitrogen), which is commercially available and used in the expression of E.coli cells, was used to monitor the expression level of the chitinase gene in E.coli BL21 cells. At the end of Magic Media incubation, cells were treated with lysis (0.1M Tris-HCl, pH 8.0, 0.3M NaCl) buffer, and homogenization was performed by ultrasonication using the M73 probe. A high amount of produced chitinase enzyme was purified by the His-Tag affinity chromatography method using the His-Trap column. The activity of the chitinase enzyme obtained in high purity was determined by the 3,5-Dinitrosalicylic acid (DNS) method which allows one to determine the amount of reducing sugars expected to be released as a result of the reaction performed by the usage of colloidal chitin as a substrate. Biochemical characterization including optimum pH, pH stability, and optimum temperature, thermal stability has been completed. A new, psychrotolerant strain, Pseudomonas mandelii KGI_MA19, was identified from sediment samples from the Antarctic King George Island, and its molecular, phenotypic, morphological, and biochemical characterization was completed. In addition, the chitinase enzyme which has an increasing impact in the industrial field has been successfully produced and biochemically characterized by using recombinant DNA methods. The cold-adaptive chitinase enzyme of the Pseudomonas mandelii KGI_MA19 strain, which was obtained for the first time within the scope of this thesis, is thought to be a promising potential biocatalyst for industrial applications.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    387351

    Farklı yöntemlerle kitosan eldesi ve karakterizasyonu

    Synthesis and characterization of chitosan by different methods

    İLKAY KOÇER

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2015

    Kimya MühendisliğiHacettepe Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HÜLYA YAVUZ ERSAN

    YRD. DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR

  2. Tez No

    772209

    Recombinant production and characterization of a novel N-glycosidase (EndoBI-2) from Bifidobacterium longum subsp. infantis 157F

    Recombinant production and characterization of a novel n-glycosidase (EndoBI-2) from Bifidobacterium longum subsp.infantis 157F

    HATİCE DUMAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    BiyolojiÇanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. SERCAN KARAV

  3. Tez No

    688848

    Recombinant production and characterization of serine protease enzyme from Virgibacillus sp. AGTR strain using site directed mutagenesis

    Virgibacillus sp. AGTR suşundan izole edilen serin proteaz enziminin bölgeye yönelik mutagenez yöntemi kullanılarak rekombinant üretimi ve karakterizasyonu

    EVRİM KAPUCU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

  4. Tez No

    542765

    İnsülin benzeri bağlayıcı proteinlerin (IGFBP) rekombinant üretimi ve karakterizasyonu

    Recombinant production and characterization of insulin-like growth factor binding proteins (IGFBP)

    ZEYNEP ERİM

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    BiyokimyaEge Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. BURCU OKUTUCU

  5. Tez No

    675991

    Recombinant production and characterization of new bifidobacterial glycosidases

    Yeni bifidobakteri glikosidazlarinin rekombinant olarak üretilmesi ve karakterizasyonu

    BERFİN SUCU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    BiyolojiÇanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi

    Biyomoleküler Bilimler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. SERCAN KARAV

Geri Dön