Geri Dön

Unrevealing the structural mechanisms of Bcl-2: From functional modulation to complex formation with Beclin 1 and Bag-1

Bcl-2'nin yapısal mekanizmalarının aydınlatılması: Fonksiyonel modülasyondan Beclin 1 ve Bag-1 ile kompleks oluşumuna doğru

  1. Tez No: 944753
  2. Yazar: MİRAY TÜRK
  3. Danışmanlar: PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyofizik, Biyokimya, Biyoteknoloji, Biophysics, Biochemistry, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 177

Özet

Apoptoz ve otofaji, hücresel kaderin belirlenmesinde kritik rol oynayan iki temel mekanizmadır. Apoptoz, organizmaların gelişimi, doku homeostazı ve bağışıklık yanıtlarında önemli bir yer tutan programlanmış hücre ölümü mekanizmasıdır. Otofaji ise hasar görmüş organellerin ve proteinlerin yıkımı ve geri dönüşümü prensibine dayanan bir hücresel homeostaz mekanizmasıdır. Hücre tipine ve diğer düzenleyici mekanizmaların aktivasyon durumuna göre hücre ölümünü ya da sağ kalımını sağlayabilmektedir. Apoptoz ve otofaji mekanizmaları düzenleme sisteminin pek çok farklı aşamasında birbirleriyle bağlantılıdır ve ortak ara düzenleyici bileşenler paylaşırlar. Apoptoz ve otofaji mekanizmaları düzenleyici proteinlerin hücre içindeki konsantrasyonu, hücre içi lokalizasyonları, translasyon sonrası modifikasyonları, etkileşim partnerlerinin hücre içi konsantrasyonları, bunların birbirlerine olan ilgisi gibi pek çok mekanizma ile control edilmektedir. Bu bağlamda, B hücre lenfoma 2 (Bcl-2) proteini, anti-apoptotik özelliği ile hücresel yaşam ve ölüm süreçlerinin düzenlenmesinde merkezi bir role sahiptir. Bcl-2, Bcl-2 protein ailesinin temel üyesidir ve anti-apoptotik özellik göstermektedir. Apoptozun önlenmesi ve otofajinin düzenlenmesi için çeşitli proteinlerle, özellikle Beclin 1 ve Bag-1 ile etkileşime girerek hücresel homeostazı kontrol eder. Bu çalışmada, Bcl-2'nin Beclin 1 ve Bag-1 ile olan etkileşimlerinin yapısal ve fonksiyonel dinamikleri detaylı bir şekilde incelenmiştir. Bcl-2 temelde, pro- ve anti-apoptotik özellik gösteren Bcl-2 ailesi üyesi proteilerle homo- ve hetero-dimerler kurma yoluyla fonksiyon göstermektedir. Pro-apoptotik Bax ve Bak ile etkileşim kurarak bunların heterodimerleşmesini önlemekte, bu sayede apoptozu baskılamaktadır. Diğer yandan Bcl-2, Beclin 1 ile etkileşerek otofajiyi baskılamaktadır. Beclin 1 temel otofaji regülatörüdür ve temel görevi, otofajinin başlatılması için gerekli olan pre-otofagozomal kompleksi kurmaktır. Bcl-2 ile etkileşimi Beclin 1'in bu kompleksi kurmasını engellemektedir, bu sayede otofaji baskılanmaktadır. Bu açıdan bakıldığında Bcl-2 hem anti-apoptotik hem de anti- otofajik fonksiyon göstermektedir. Çalışmanın ilk bölümünde, tam uzunlukta, katlanmış ve fonksiyonel, ligand bağlı olmayan Bcl-2 proteininin üretim ve saflaştırması amacıyla geliştirilen prosesin detayları belirtilmiş, proteinin ikincil yapısı ve termal stabilitesi gibi özellkleri belirlenmiştir. Hücre ölüm ve sağ kalım mekanizmalarındaki temel düzenleyici görevi sebebiyle Bcl-2 pek çok çalışmanın konusu olmuş, yapısı aydınlatılmaya çalışılmış hatta inhibisyonuna yönelik olarak pek çok ilaç tasarlanmış, bunların bir kısmı kısmen de olsa başarılı olmuştur. Ancak Bcl-2'nin biyokimyasal yapısı dolayısıyla recombinant yolla tam boyutlu Bcl-2 üretimi günümüze kadar mümkün olamamıştır. FLD ve TM domenlerinin varlığı rekombinant üretim aşamasında Bcl-2'nin hücre içerisinde doğru katlanmasını zorlaştırmakta, protein agregasyonunu tetiklemektedir. Bu sebeple literatürdeki çalışmalar kısa ya da kimerik Bcl-2 formları ile sınırlı kalmıştır. Literatürdeki çalışmalarda ayrıca protein stabilitesini arttırmak için ligand kullanılmıştır. Bu sebeple Bcl-2'nin ligand bağlı olmayan apo yapısı da bilinmemektedir. Tüm bu sebepler dolayısıyla Bcl-2 yapısı tam olarak aydınlatılamamış, Bcl-2'nin terapötik amaçlı olarak hedeflenmesinde istenen başarı elde edilememiştir. Biyokimyasal analizlere ek olarak çalışmaızda ayrıca, tam boyutlu ve ligand bağlı olmayan Bcl-2 proteinin konformasyonel dinamikleri hidrojen/döteryum değişim hızına dayanarak analiz edilmiştir ve ilk defa bu çalışma ile tam boyutlu, apo-Bcl- 2'nin dinamik yapısı ortaya konulmuştur. Moleküler dinamik (MD) simülasyonları ve Hidrojen-Döteryum Değişim Kütle Spektrometrisi (HDX-MS) analizleri, Bcl-2'nin ligand baglanma oyuğunun ligand bağlayabilen ya da halihazırda ligand bağlı olan“açık”form ve ligand bağlayamayan“kapalı”konformasyonlar arasında çeşitli konformasyonlara sahip olduğunu, bu konformasyonların R110-E136 ve D111-R146 rezidüleri arasında kurulan tuz köprüsü etkileşimleri ile düzenlendiğini ortaya koymuştur. Bu yapısal dönüşüm, Bcl-2'nin ligand bağlanma boşluğunun erişilebilirliğini belirleyen önemli bir mekanizmadır. Çalışma kapsamında gerçekleştirilen in siliko moleküler dinamik simülasyonlar ve in vitro yönlendirilmiş mutasyon çalışmaları kapsamında elde edilen R110A mutasyonu ile gerçekleştirilen çalışmalar sonucunda 110. pozisyonda bulunan arjinin amino asitinin bu tuz köprüsü ağının oluşmasında kritik rol oynadığı, R110A mutasyonu sonucunda tuz köprüsü ağının bozulduğu, buna bağlı olarak ligand bağlama oluğunun konformasyonunun değişmesiyle Bcl-2'nin“açık/yarı-açık”konformasyona geçtiği gözlenmiştir. Bu durumun ligand bağlama kapasitesini arttırdığı da görülmüştür. R110A mutasyonu ayrıca Bcl-2'nin termal stabilitesini de azaltmaktadır. Elde edilen sonuçlar, Bcl-2'de gerçekleşen bu konformasyon değişiminin, apoptoz ve otofaji süreçlerindeki rolünü etkileyen önemli bir faktör olduğunu göstermektedir. Ek olarak, Bcl-2'nin aktivitesinde kritik rol oynadığı literatürde bilinen hareketli ilmek domeni (FLD) ve transmembran domeni (TM) ile ilgili olarak ilk defa yapısal veri elde edilmiştir. İleriki çalışmalarda, çalışmamızda elde edilen tam boyutlu Bcl-2 eldesi yöntemi kullanılarak bu bölgelerin protein fonksiyonundaki etkisinin ortaya çıkartılması konusunda daha çok bilgi elde edilebilmesi mümkün olabilecektir. İkinci bölümde, otofajinin düzenlenmesinde kritik bir rol oynayan Bcl-2/Beclin 1 kompleksinin etkileşim mekanizmaları detaylandırılmıştır. HDX-MS analizleri ile hem tam uzunlukta Beclin 1'in zaman bağımlı dinamik yapısı literatürde ilk olarak ortaya konulmuş hem de Bcl-2/Beclin 1 kompleksinde görev alan Bcl-2'ye ve Beclin 1'e ait rezidüler belirlenmiştir. Tam uzunlukta yapıların kullanımı sayesinde, etkileşimde rol oynayan tüm kritik bölgeler kapsamlı bir şekilde değerlendirilmiştir. Literatürde yer alan çalışmalar, Beclin 1'in Bcl-2'nin ligand bağlanma oluğuna dizisi korunan BH3 domaini aracılığıyla bağlandığını göstermektedir. Çalışmamızda, literatürle tutarlı olarak Beclin 1'in BH3 domeninin Bcl-2 ile etkileşim kurduğu doğrulanmıştır. Ayrıca, Bcl-2/Beclin 1 etkileşiminde görevli olan Bcl-2'nin ligand bağlanma oluğundaki kritik kalıntılar da belirlenmiştir. HDX-MS analizleri ayrıca, Bcl-2'nin Beclin 1 üzerindeki alternatif ve literatürde henüz gösterilmemiş yeni bağlanma bölgeleri olduğunu da ortaya çıkarmıştır. Bilinen etkileşim bölgesi olan BH3 domenini içermeyen kesilmiş Beclin 1 protein domenleri ve tam boyutlu Bcl-2 proteini ile gerçekleştirilen in vitro kompleks oluşum deneyleri bu yeni bağlanma bölgelerini doğrulamıştır. Bu yeni bölgelerin otofajinin terapötik amaçlı olarak hedeflenmesinde rol oynayabileceği ve yeni ilaç hedef bölgesi olarak değerlendirilebileceği düşünülmektedir. Bcl-2 ligand bağlanma boşluğunun hedeflenmesindeki sınırlamalar göz önüne alındığında, yeni keşfedilen bu bölgelerin terapötik olarak hedeflenmesinin, otofajinin kanser ve nörodejeneratif hastalıklarda modüle edilmesi için yeni terapötik hedefler olarak değerlendirilebileceği düşünülmektedir. Bcl-2/Beclin 1 kompleksinin oluşumu durumunda Bcl-2'nin bu alternatif bölgelerden öncelikle hangisi ya da hangilerini tercih ettiği, bunun hangi hücresel durumlarda değiştiği ya da bunlara olan bağlanma afinitesi henüz bilinmemektedir. Bcl-2 ve Beclin 1 kompleksinin sitokiyometrisini belirlemek için gerçekleştirdiğimiz Nativ-PAGE ve boyut-dışlama kromatografisi (SEC) çalışmalarında, Bcl-2'nin Beclin 1'in tam yarı boyutunda olması dolayısıyla net sonuç alınamamıştır. Çalışmanın son bölümü, Bcl-2 ve Bag-1 etkileşimine odaklanmaktadır. Bag-1, hücre içerisinde pek çok farklı proteinle etkileşerek hücrede çeşitli düzenleme mekanizmalarında görev almaktadır. Bag-1 bir yandan Hsp-70 ile etkileşerek onun nükleotit değişim faktörü (NEF) olarak görev yapmakta, böylece Hsp70'in fonksiyon göstermesine yardımcı olmaktadır. Diğer yandan ise Bcl-2 ve Raf-1 gibi hücre ölüm ve sağ kalım yolaklarında görevli temel regülatörlerle etkileşerek bunların fonksiyonunu düzenlemektedir. Literatürde Bag-1 Bcl-2'nin anti-apoptotik fonksiyonunu artıran bir protein olarak bilinmektedir ve ismi de bu etkileşimden gelmektedir. Literatüre göre Bag-1, Bcl-2'yi stabilize etmekte ve bu sayede apoptotik düzenleyicilerle olan ilişkisini güçlendirmektedir. Bununla birlikte, Bag-1/Bcl-2 etkileşiminin yapısı tam olarak çözülememiş, bu etkileşimin nasıl gerçekleştiriği gösterilememiş ve etkileşimde görevli olan rezidüler belirlenememiştir. Bu sebeple, bu etkileşiminin Bcl-2 aktivitesinin regülasyonu için kullanılması için mümkün olamamıştır. Bu çalışma kapsamında Bag-1/Bcl-2 kompleksi hücre dışı ortamda kurularak biyokimyasal deneyler ve yapısal analizler kullanılarak Bcl-2 ve Bag-1 arasındaki etkileşim yüzeyleri belirlenmiştir. Literatürdeki çeşitli çalışmalar bu etkileşimin ATP-bağımlı olarak gerçekleşebileceğini öne sürmektedir. Çalışma kapsamında ATP'nin Bag-1/Bcl-2 etkileşimindeki rolü ortaya konmuştur. Özetle, çalışma kapsamında, tam boyutlu ve fonksiyonel Bcl-2 eldesine yönelik üretim ve saflaştırma prosesi geliştirilmiştir. Gerçekleştirilen biyokimyasal ve yapısal analizler sonucu elde edilen veriler Bcl-2'nin konformasyonel esnekliğinin hücresel homeostaz üzerindeki etkilerini anlamamıza yardımcı olmaktadır. Diğer yandan, çalışma kapsamında Bcl-2'nin Beclin 1 ve Bag-1 ile olan etkileşimleri yapısal ve fonksiyonel düzeyde kapsamlı bir şekilde incelenerek, apoptoz ve otofajinin ana düzenleyici mekanizmalarına ışık tutulmuştur. Elde edilen bulgular, Bcl-2/Beclin 1 ve Bcl-2/Bag-1 protein-protein etkileşimlerinin terapötik olarak hedeflenmesinde kritik rol oynayacak etkileşim bölgeleri ortaya koymaktadır. Bu veriler kullanılarak geliştirilecek terapötik moleküllerin Bcl-2, Beclin 1 ve Bag-1 arasındaki protein- protein etkileşimlerin spesifik olarak hedeflenmesini sağlayabileceği ve apoptoz ve/veya otofaji mekanizmalarındaki aksaklıklar sonucu gelişen kanser ve nörodejeneratif hastalıklar gibi çeşitli hastalıkların tedavisine katkı sunulacağı düşünülmektedir.

Özet (Çeviri)

Apoptosis and autophagy are two fundamental cellular processes that regulate cell fate. Apoptosis is a programmed cell death mechanism essential for development, tissue homeostasis, and immune responses, whereas autophagy ensures cellular homeostasis by degrading and recycling damaged organelles and proteins. These pathways share common regulatory components, with B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) playing a crucial role as an anti-apoptotic protein. Bcl-2 inhibits programmed cell death and regulates cell survival and death by interacting with various proteins, such as Beclin 1 and Bag- 1. The balance between these processes is critical for cellular integrity, and dysregulation is frequently associated with various pathologies, including cancer and neurodegenerative disorders. This study aims to elucidate the structural and functional dynamics of Bcl-2 interactions with Beclin 1 and Bag-1 to gain mechanistic insights into its dual regulatory role in apoptosis and autophagy. The first chapter of this study focuses on the newly developed production and purification strategy of the full-length, folded and functional apo-Bcl-2, highlighting its conformational dynamics, emphasizing its transition between closed and open states. Molecular dynamics (MD) simulations and Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) analyses identified a crucial conformational shift mediated by salt bridge interactions involving residues R110-E136 and D111-R146. These interactions regulate the accessibility of Bcl-2's ligand-binding cavity, suggesting that its structural conformation plays a significant role in its dual function. Additionally, the R110A mutation was introduced to disrupt the salt bridge network, resulting in an“open”conformation that enhances ligand binding. The findings indicate that the flexibility of Bcl-2 influences its ability to function in both apoptosis and autophagy, providing a molecular framework for understanding its interactions with other regulatory proteins. The second section investigates the Bcl-2/Beclin 1 complex, which is central to macro- autophagy regulation. HDX-MS analysis of full-length Beclin 1 revealed its time- dependent dynamic structure. Structural and biochemical assays identified responsible residues of both Bcl-2 and Beclin 1 for Bcl-2/Beclin 1 complex. The utilization of full- length structures for both Bcl-2 and Beclin 1 allowed for a comprehensive analysis of all relevant residues. The literature reports that Beclin 1 binds to the ligand binding cavity of Bcl-2 through a conserved BH3 domain interaction modulated by Bcl-2's conformational states. Consistent with previous literature, the BH3 domain of Beclin 1 has been identified as the primary interaction site in the Bcl-2/Beclin 1 complex. Also, key residues within Bcl-2's ligand-binding groove critical for Beclin 1 sequestration were identified. Furthermore, time-dependent HDX-MS analyses demonstrated alternative Bcl-2 binding sites on Beclin 1, which was also proved by the in vitro complex formation assays, probably to regulate autophagy intiation. Considering the limitations on the targeting of Bcl-2 ligand binding cavity, these newly identified regions may constitute new therapeutic targets for small molecule or peptide inhibitors to modulate autophagy in cancer and neurodegenerative diseases. The final section focuses on the interaction between Bcl-2 and Bag-1, a co-chaperone protein that enhances Bcl-2's anti-apoptotic function. According to the literature, Bag- 1 stabilizes Bcl-2 and promotes its association with apoptotic regulators. Using a combination of biochemical assays and structural analyses, distinct interaction surfaces between Bag-1 and Bcl-2 were identified. Our data also specified the role of ATP on the interaction of Bag-1 and Bcl-2. Taken together, the biochemical and structural analyses conducted in this study contribute to our understanding of the impact of Bcl-2's conformational flexibility on cellular homeostasis. Additionally, the interactions of Bcl-2 with Beclin 1 and Bag-1 have been comprehensively examined at both structural and functional levels, shedding light on the key regulatory mechanisms of apoptosis and autophagy. The findings reveal critical interaction sites in the Bcl-2/Beclin 1 and Bcl-2/Bag-1 protein- protein interactions that could serve as therapeutic targets. Based on these data, the development of therapeutic molecules specifically targeting the protein-protein interactions among Bcl-2, Beclin 1, and Bag-1 is expected to contribute to the treatment of various diseases, including cancer and neurodegenerative disorders.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    904954

    Time-resolved investigations on the charge carrier dynamics of CuBi2O4 and Cu2O photocathodes for photoelectrochemical hydrogen evolution reaction

    Fotoelektrokimyasal hidrojen evrim reaksiyonu için CuBi2O4 ve Cu2O fotokatotların yük taşıyıcı dinamikleri üzerine zamana bağlı incelemeler

    EMİR ARDALI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    EnerjiKoç Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. SARP KAYA

  2. Tez No

    887227

    Dolusavak plaka boşlukları boyunca akım ve türbülans karakteristiği

    Flow and turbulent characteristic over spillways slab gaps

    MUHAMMED FATİH ÖZÜN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    İnşaat Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İnşaat Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ŞEVKET ÇOKGÖR

  3. Tez No

    879686

    Machine-learning approaches for neurological disorder diagnosis from genomic and neuroimaging data

    Genomik ve nörogörüntüleme verilerinden nörolojik bozukluk teşhisi için makine öğrenmesi yaklaşımları

    İSMAİL BİLGEN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    Bilgisayar Mühendisliği Bilimleri-Bilgisayar ve Kontrolİstanbul Teknik Üniversitesi

    Bilgisayar Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. BEHÇET UĞUR TÖREYİN

  4. Tez No

    562059

    Disease gene identification using linkage and exome analyses

    Bağlantı ve ekzom analizleri kullanarak hastalık geni keşfi

    İLKER KARACAN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    Genetikİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. EDA TAHİR TURANLI

  5. Tez No

    794591

    Flexible optoelectronic biointerfaces using quantum dots and pseudocapacitive materials for photoelectric stimulation of neurons

    Nöronların fotoelektrik uyarımı için kuantum nokta ve pseudokapasitör malzeme tabanlı esnek optoelektronik biyoarayüzler

    ONURALP KARATÜM

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    Elektrik ve Elektronik MühendisliğiKoç Üniversitesi

    Elektrik-Elektronik Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. SEDAT NİZAMOĞLU

Geri Dön